【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于离散解链分析的方法和组合物本申请要求于2018年1月22日提交的美国临时专利申请No.62/620,298的权益，其全部内容通过引用并入本文。专利技术背景1.
本专利技术一般性地涉及分子生物学领域。更具体地，本专利技术涉及用于鉴定和量化生物样品中的核酸靶标的方法。2.
技术介绍
对双链体核酸进行的解链分析(meltanalysis)利用解链或退火峰来区分扩增子同一性，但是除非扩增子或核酸被明确标记，否则在同一温度附近解链的扩增子或核酸双链体中不容易区分解链峰。此外，由于缓慢升高或降低样品温度和在多个温度下获取图像所需的时间，解链分析通常在靶扩增后进行，并增加了测定的周转时间。数字聚合酶链式反应(digitalpolymerasechainreaction，dPCR)是对常规PCR的改进，可用于直接量化和克隆扩增核酸，例如DNA、cDNA或RNA。常规PCR通常用于测量核酸量，并且通过每个样品的单个反应进行。使用dPCR方法，也可以对样品进行单个反应，然而样品被分成许多分区(partition)，并且该反应在每个分区中单独进行。这种分离允许更可靠地收集并进行灵敏的核酸量的测量。当前用于dPCR的方法依赖于终点PCR来量化靶核酸的存在。终点PCR分析在多种方式上受到限制。首先，DNA嵌入染料和TaqMan探针的使用导致非特异性扩增在分区中产生假阳性信号的可能性。另外，现有的商业系统在可用荧光通道的数量上有局限性，这限制了检测多个靶标的能力。最后，将分区分类为阳性(pisitiv...
【技术保护点】
1.在反应混合物中对标记的双链体核酸进行解链分析的方法，所述标记的双链体核酸具有预定Tm，并且所述方法包括：/n(a)在低于所述标记的双链体核酸的预定Tm的第一温度下测量来自所述标记的双链体核酸的第一信号；/n(b)在高于所述标记的双链体核酸的预定Tm的第二温度下测量来自所述标记的双链体核酸的第二信号，而不在所述预定Tm下测量信号；以及/n(c)比较所述第一信号和所述第二信号，当所述第一与第二信号之间存在变化时，确定所述标记的双链体核酸是所述反应混合物中靶标特异性探针与靶序列特异性杂交的结果。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180122 US 62/620,2981.在反应混合物中对标记的双链体核酸进行解链分析的方法，所述标记的双链体核酸具有预定Tm，并且所述方法包括：
(a)在低于所述标记的双链体核酸的预定Tm的第一温度下测量来自所述标记的双链体核酸的第一信号；
(b)在高于所述标记的双链体核酸的预定Tm的第二温度下测量来自所述标记的双链体核酸的第二信号，而不在所述预定Tm下测量信号；以及
(c)比较所述第一信号和所述第二信号，当所述第一与第二信号之间存在变化时，确定所述标记的双链体核酸是所述反应混合物中靶标特异性探针与靶序列特异性杂交的结果。
2.权利要求1所述的方法，其中所述靶标特异性探针是在所述靶标特异性探针与所述靶序列特异性杂交后被切割的可切割探针。
3.权利要求1或2所述的方法，其中不在所述标记的双链体核酸的预定Tm的2摄氏度内测量信号。
4.权利要求1或2所述的方法，其中不在所述标记的双链体核酸的预定Tm的5摄氏度内测量信号。
5.权利要求1或2所述的方法，其中所述第一温度与所述第二温度之间的差异大于2摄氏度。
6.权利要求1或2所述的方法，其中所述第一温度与所述第二温度之间的差异大于5摄氏度。
7.权利要求1或2所述的方法，其中所述第一温度与所述第二温度之间的差异大于8摄氏度。
8.权利要求1或2所述的方法，其还包括以下步骤：在所述反应混合物中的所有标记的双链体核酸均被变性的第三温度下测量第三信号，并且将所述第一和第二信号相对于所述第三信号归一化。
9.权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物包含至少两种不同的双链体核酸，每种具有独特的预定Tm，并且每种不同的双链体核酸具有同一信号产生标记，所述方法还包括以下步骤：
d)在低于所述标记的双链体核酸的独特的预定Tm的温度和高于所述标记的双链体核酸的独特的预定Tm的温度下测量来自每种不同的标记的双链体核酸的信号，并且
其中，对于每种不同的标记的双链体核酸，在低于所述独特的预定Tm的温度下测得的信号与在高于所述独特的预定Tm的温度下测得的信号之间的变化表明所述标记的双链体核酸是靶标特异性探针与其靶标特异性杂交的结果。
10.权利要求9所述的方法，其中信号在不超过n+1个不同的温度下测量，其中n是所述反应混合物中不同靶标特异性探针的数目。
11.权利要求1或2所述的方法，其中所述第一与第二信号之间的变化超过预定阈值。
12.用于确定样品中至少一种靶核酸序列的存在的方法，所述方法包括：
a)在杂交条件下，使所述样品与至少一种可切割靶标特异性探针接触，如果所述靶核酸序列存在于反应混合物中，所述探针能够与所述靶核酸序列特异性杂交，
b)将与所述靶核酸序列特异性杂交的所述探针进行切割以形成截短的探针；
c)提供条件以使所述截短的探针与捕获序列杂交；
d)使所述截短的探针延伸以形成具有预定Tm和信号产生标记的双链体核酸；
e)在低于所述预定Tm的温度下测量第一信号和在高于所述预定Tm的温度下测量第二信号，而不在所述预定Tm下测量信号，以及
f)通过检测所述第一与第二信号之间的变化来确定所述靶核酸序列的存在。
13.权利要求12所述的方法，其中所述样品与至少两种不同的可切割探针接触，每种不同的可切割探针对于不同的靶核酸序列具有特异性，其中在其特异性靶核酸序列的存在下，每种不同的可切割探针形成具有独特的预定Tm的双链体核酸，并且其中所述具有独特的预定Tm的双链体核酸均具有同一信号产生标记，所述方法还包括以下步骤：对于每种具有独特的预定Tm的双链体核酸，在低于所述预定Tm的温度下测量第一信号，并在高于所述预定Tm的温度下测量第二信号，并通过检测所述第一与第二信号之间的变化来确定所述靶核酸序列的存在。
14.权利要求13所述的方法，其中在不超过n+1个不同的温度下测量信号，其中n是所述反应混合物中不同的可切割探针的数目。
15.权利要求13所述的方法，其中所述不同的双链体核酸的独特的预定Tm相差至少2摄氏度。
16.权利要求13所述的方法，其中所述不同的双链体核酸的独特的预定Tm相差至少5摄氏度。
17.权利要求13所述的方法，其中所述不同的双链体核酸的独特的预定Tm相差至少10摄氏度。
18.权利要求12所述的方法，其中所述捕获序列和截短的探针是单分子的。
19.权利要求12所述的方法，其中捕获序列和截短的探针是双分子的。
20.权利要求12所述的方法，其中当所述第一信号与所述第二信号的比超过预定阈值时，确定存在所述靶核酸。
21.权利要求12所述的方法，其中不在所述预定Tm的2摄氏度以内的温度下测量信号。
22.权利要求12所述的方法，其中不在所述预定Tm的5摄氏度以内的温度下测量信号。
23.权利要求12所述的方法，其中所述至少一种可切割探针用报道分子-猝灭剂对的第一成员标记，并且所述至少一种可切割探针在与其靶核酸序列杂交时采用第一构象。
24.权利要求23所述的方法，其中所述至少一种可切割探针与其靶序列的特异性杂交导致所述探针在切割位点处切割、所述截短的探针从所述靶核酸序列释放以采用第二构象，以及从所述切割位点开始的链延伸。
25.权利要求24所述的方法，其中链延伸包括并入与所述报道分子-淬灭剂对的第一成员相互作用的报道分子-淬灭剂对的第二成员。
26.权利要求24所述的方法，其中所述第一构象是线性构象，并且所述第二构象是发夹构象。
27.在反应混合物中对标记的双链体核酸进行解链分析的方法，所述方法包括：
a)在所述标记的双链体核酸处于第一构象的第一温度下测量来自所述标记的双链体核酸的第一信号；
(b)在所述标记的双链体核酸处于第二构象的第二温度下测量来自所述标记的双链体核酸的第二信号，其中不在所述第一与第二温度之间的温度下测量信号；以及
(c)通过比较所述第一信号与所述第二信号来确定所述标记的双链体核酸是否是靶标特异性探针与靶序列特异性杂交的结果，其中所述第一信号与所述第二信号之间的变化表明所述标记的双链体核酸是靶标特异性探针与靶序列特异性杂交的结果。
28.权利要求27所述的方法，其中所述反应混合物包含至少两种不同的标记的双链体核酸，每种不同的标记的双链体核酸能够在独特的温度下采用所述第二构象，并且每种不同的标记的核酸具有同一信号产生标记，所述方法还包括以下步骤：对于每种标记的双链体核酸，在所述标记的双链体核酸主要处于第一构象的温度下测量第一信号，并在所述标记的双链体核酸主要处于第二构象的温度下测量第二信号，并比较所述第一与第二信号。
29.权利要求28所述的方法，其中在不超过n+1个不同的温度下测量信号，其中n是所述反应混合物中不同双链体核酸的数目。
30.权利要求27所述的方法，其中所述第一构象是发夹构象，并且所述第二构象是线性构象。
31.权利要求27所述的方法，其中所述靶标特异性探针是标记有报道分子-猝灭剂对的第一成员的可切割探针。
32.权利要求31所述的方法，其中所述靶标特异性探针与其靶序列的特异性杂交导致所述探针在切割位点处切割以形成截短的探针、所述截短的探针从所述靶核酸序列中释放以形成发夹探针，以及从所述切割位点开始的链延伸。
33.权利要求32所述的方法，其中链延伸包括并入与所述报道分子-淬灭剂对的第一成员相互作用的报道分子-淬灭剂对的第二成员，从而导致信号变化。
34.用于检测样品中至少一种靶核酸序列存在与否的方法，所述方法包括：
a)使所述样品与至少一种在靶核酸序列存在时能够与所述靶核酸序列特异性杂交的可切割探针接触，所述可切割探针包含信号产生标记；
b)对与所述靶核酸序列特异性杂交的探针进行切割以形成截短的探针；
c)提供条件以使所述截短的探针与捕获序列杂交，所述捕获序列包括与所述截短的探针互补的序列；
d)使用所述捕获序列为模板使所述截短的探针延伸，以形成具有预定Tm的双链探针；
e)在低于所述预定Tm的第一温度下测量来自所述信号产生标记的第一信号，以及在高于所述预定Tm的第二温度下测量第二信号，而不在所述预定Tm下测量信号；以及
f)通过检测在所述第一温度与所述第二温度下测得的信号的变化来确定所述靶核酸序列的存在。
35.权利要求34所述的方法，其中所述样品与两种或更多种不同的可切割探针接触，每种均对不同的靶核酸具有特异性，并且每种均能够在其各自的靶核酸存在下形成具有独特的预定Tm的双链探针，并且其中每种不同的双链探针均包括相同的报道分子-猝灭剂对，所述方法还包括以下步骤：对于每种不同的双链探针，在低于所述预定Tm的第一温度下测量第一信号和在高于所述预定Tm的第二温度下测量第二信号，并比较针对每种不同的双链探针测得的所述第一与第二信号。
36.权利要求34所述的方法，其中所述捕获序列和截短的探针是单分子的。
37.权利要求34所述的方法，其中所述捕获序列和截短的探针是双分子的。
38.权利要求35所述的方法，其中所述样品在单个反应室中与两种或更多种不同的可切割探针接触。
39.权利要求38所述的方法，其中在不超过n+1个不同的温度下测量信号，其中n是所述反应室中不同的可切割探针的数目。
40.权利要求35所述的方法，其中所述不同的双链探针的独特的预定Tm相差至少2摄氏度。
41.权利要求35所述的方法，其中所述不同的双链探针的独特的预定Tm相差至少5摄氏度。
42.权利要求35所述的方法，其中所述不同的双链探针的独特的预定Tm相差至少8摄氏度。
43.权利要求34所述的方法，其中当所述第一信号与所述第二信号的比超过预定阈值时，确定存在所述靶核酸。
44.权利要求34所述的方法，其中不在所述预定Tm的2摄氏度以内的温度下测量信号。
45.权利要求34所述的方法，其中不在所述预定Tm的5摄氏度以内的温度下测量信号。
46.权利要求34所述的方法，其中所述信号产生标记是报道分子-猝灭剂对的第一成员，并且所述双链探针包括与所述报道分子-猝灭剂对的第一成员相互作用的报道分子-猝灭剂对的第二成员。
47.权利要求46所述的方法，其中所述可切割探针包含连接有所述信号产生标记的第一非天然核苷酸，所述双链体核酸包含与所述第一非天然核苷酸杂交的第二非天然核苷酸，并且所述报道分子.猝灭剂对的第二成员与所述第二非天然核苷酸连接。
48.权利要求46和47所述的方法，其中所述报道分子-猝灭剂对的第一成员是荧光实体，并且所述报道分子-猝灭剂对的第二成员是猝灭所述荧光实体的荧光的猝灭剂。
49.权利要求47所述的方法，其中所述第一和第二非天然核苷酸是iso-C和iso-G中之一。
50.对多种标记的核酸双链体进行解链分析的方法，所述方法包括：
(a)至少提供第一、第二和第三标记的双链体核酸，
其中所述第一、第二和第三标记的双链体核酸中的每个均具有独特的预定Tm，并且
所述第二标记的双链体核酸的独特的预定Tm高于所述第一标记的双链体核酸的独特的预定Tm，并且
所述第三标记的双链体核酸的独特的预定Tm高于所述第二标记的双链体核酸的独特的预定Tm，并且
其中所述第一、第二和第三标记的双链体核酸被同一标记进行标记，
(b)在低于所述第一标记的双链体核酸的独特的预定Tm的第一温度下检测来自所述第一、第二和第三标记的双链体核酸的第一信号；
(c)在第二温度下检测来自所述第一、第二和第三标记的双链体核酸的第二信号，所述第二温度介于所述第一标记的双链体核酸的独特的预定Tm与所述第二标记的双链体核酸的独特的预定Tm之间；
(d)在第三温度下检测来自所述第一、第二和第三标记的双链体核酸的第三信号，所述第三温度介于所述第二标记的双链体核酸的独特的预定Tm与所述第三标记的双链体核酸的独特的预定Tm之间；
(e)在高于所述第三标记的双链体核酸的独特的预定Tm的第四温度下检测来自所述第一、第二和第三标记的双链体核酸的第四信号；以及
(f)通过比较所述第一、第二、第三和第四信号来确定所述第一、第二和第三标记的双链体核酸中的一种或更多种是否是靶标特异性探针切割的结果，其中所述第一信号与所述第二信号之间的变化表明所述第一标记的双链体核酸是第一靶标特异性探针切割的结果，所述第二信号与所述第三信号之间的变化表明所述第二标记的双链体核酸是第二靶标特异性探针切割的结果，并且所述第三信号与所述第四信号之间的变化表明所述第三标记的双链体核酸是第三靶标特异性探针切割的结果。
51.权利要求50所述的方法，其中不在所述第一、第二和第三标记的双链体核酸的独特的预定Tm下检测信号。
52.权利要求50所述的方法，其中所述第一温度与所述第二温度之间的差异大于2摄氏度，所述第二温度与所述第三温度之间的差异大于2摄氏度，并且所述第三温度与所述第四温度之间的差异大于2摄氏度。
53.权利要求12、27或34所述的方法，其还包括以下步骤：在所述反应混合物中的所有双链体核酸均被变性的第三温度下测量第三信号，并且将所述第一和第二信号相对于所述第三信号归一化。
54.权利要求1、12、27、34或50所述的方法，其中所述步骤在dPCR反应中的多个分区上进行。
55...
【专利技术属性】
技术研发人员：道格拉斯·惠特曼，珍妮弗·贝尔尼尔，威廉·旺，
申请(专利权)人：卢米耐克斯公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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