用于检测和分析结核分枝杆菌的组合物和方法技术

本文提供了可用于检测MTB的组合物和方法。具体地，本文提供了特异性地且灵敏地检测样品中的MTB的试剂盒、试剂、反应混合物和方法，包括它们用于核酸扩增和检测程序。

Compositions and methods for the detection and analysis of Mycobacterium tuberculosis

Compositions and methods for detecting MTB are provided in this paper. Specifically, the present invention provides kits, reagents, reaction mixtures and methods for the detection of MTB in samples specifically and sensitively, including their use in nucleic acid amplification and detection procedures.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测和分析结核分枝杆菌的组合物和方法
本专利技术涉及结核分枝杆菌（mycobacteriumtuberculosis）。具体地，本专利技术涉及用于检测结核分枝杆菌的组合物和方法。
技术介绍
结核分枝杆菌(MTB)构成世界上对公共卫生的严重威胁，并且作为由单一传染性病原体引起的全世界最大杀手仅次于HIV/AIDS(Warren等人,DifferentiationofMycobacteriumtuberculosiscomplexbyPCRamplificationofgenomicregionsofdifference,2006年7月,IntJTubercLungDis.10(7):818-822)。所述CDC报告称，在2011年，估计有870万新MTB病例(13%被HIV共感染)；140万人死于MTB，包括大概100万例属于HIV-阴性个体的死亡和430,000属于HIV-阳性的人。世界卫生组织(WHO)报告称，MTB是女性的顶尖杀手之一，在2011年300,000例死亡属于HIV-阴性女性，且200,000例死亡属于HIV-阳性女性。它是15-44岁的女性的前三大死亡原因。MTB也是具有HIV的存活人的主要杀手，造成所有死亡的四分之一。在2011年估计有50万病例和64,000例死亡属于儿童。多药抗性的MTB(MDR-TB)正在增加中，并且存在于几乎所有调查的国家中。在地理学上，MTB的负担在亚洲和非洲是最高的。WHO报告称，全面MTB病例检测在低收入国家(LIC)中仍然小于60%，且在全球仅占66%。也就是说，在2011年在估计的870万因MTB患病的人中，290万具有活动性疾病的人没有被诊断和报告给国家MTB控制程序。另外，仅19%的MDR-MTB病例被适当地诊断和报告。少于1/20的新MTB患者进行过药物易感性测试。由于MTB的传播风险、药物抗性株的出现潜力和被HIV-1感染的患者中疾病的严重程度，低价的、快速的且准确的MTB分子测试是非常重要的。常规培养是费时的，且可以需要多达6周。抗酸涂片的显微镜检查是检测分枝杆菌的最快方法，但是它是不灵敏的和非特异性的。专利技术概述本文提供了可用于检测MTB的组合物和方法。具体地，本文提供了特异性地且灵敏地检测样品中的MTB的试剂盒、试剂、反应混合物和方法，包括它们用于核酸扩增和检测程序。这样的组合物和方法包括用于检测不同人样品（诸如痰、支气管肺泡灌洗液(BAL)以及痰和BAL样品的N-乙酰基-L-半胱氨酸(NALC)-NaOH沉淀物）中的MTB复合物的引物、探针、引物集合、引物和探针集合和方法。在某些实施方案中，将本文中作为SEQIDNO:1-9提供的多核苷酸试剂中的两种或更多种组合在组合物(例如，试剂集合、试剂盒、反应混合物等)中。在某些实施方案中，所述核酸试剂中的一种或多种或全部包含可检测的部分(例如，合成的标记)。在某些实施方案中，所述组合物包含一种或多种引物SEQIDNO:1-4或7-8。在某些实施方案中，所述组合物包含一个或多个引物对SEQIDNO:1和2、3和4、或7和8。在某些实施方案中，所述组合物包含一种或多种SEQIDNO:5、6或9的探针(例如，标记的探针)。在某些实施方案中，所述组合物包含引物和探针集合：SEQIDNO1-2和5、3-4和6、或7-9。在某些实施方案中，所述组合物包含内部对照试剂，诸如SEQIDNO:7-9。在某些实施方案中，所述组合物包含含有SEQIDNO:5和6的双探针系统。在某些实施方案中，所述组合物和方法采用包含多核苷酸组分的试剂集合，所述多核苷酸组分具有引物、探针、引物集合和/或探针集合。在某些实施方案中，所述组合物的多核苷酸组分由上述的引物、探针、引物集合或探针集合组合组成。作为反应混合物，所述组合物可以由这样的多核苷酸以及在样品中包括的任何多核苷酸(即，唯一非样品核酸分子是由SEQIDNO:1-9个别地或组合地(例如，上述组合)代表的多核苷酸)组成。本文提供的引物集合包含两种引物，且可用于扩增靶序列，例如，在PCR中。在某些实施方案中，所述组合物包含至少两种引物以及一种或多种(例如，两种或更多种)检测由所述引物产生的扩增子的探针。本文还提供了用于检测样品中的MTB的方法。在某些实施方案中，所述方法包括：(a)形成反应混合物，其包含核酸扩增试剂、至少本文描述的多核苷酸引物或探针、和可能含有至少一个靶序列的测试样品；和(b)使所述混合物处于扩增条件以产生靶序列的互补核酸序列的至少一个拷贝。在某些实施方案中，所述方法还包括检测产生的扩增子。在某些实施方案中，所述检测包括(c)使探针与靶序列的互补核酸序列杂交从而形成杂合物，所述杂合物包含探针和靶序列的互补核酸序列；和(d)直接地或间接地检测所述杂合物作为MTB在测试样品中的存在的指示。进一步，当扩增是PCR或类似的热循环扩增过程时，可以将步骤(b)重复多次以增加靶序列拷贝的数目。根据另一个实施方案，检测MTB和一种或多种另外的传染性病原体(例如，HIV)或其它核酸分子(例如，人序列)。因此，在某些实施方案中，组合物包含用于检测这样的其它试剂或核酸分子的试剂。在某些实施方案中，所述组合物和方法还采用对照试剂或试剂盒组分(例如，阳性对照、阴性对照)。在某些实施方案中，所述对照试剂包括合成的靶核酸。在某些实施方案中，所述对照试剂包括用于检测预期存在于样品中的MTB、人或其它序列的试剂。在某些实施方案中，选择对照靶核酸（无论是合成的还是在样品中内源性的），使得扩增MTB靶核酸的扩增引物也扩增对照靶核酸。在某些这样的实施方案中，检测MTB靶核酸或从其产生的扩增子的探针不会检测对照靶标或从其产生的扩增子。在某些实施方案中，提供了这样的对照探针，其检测对照靶核酸或从其产生的扩增子，但是不检测MTB靶核酸或从其产生的扩增子。在某些实施方案中，提供了用于定量的内部标准品。在某些实施方案中，除了上面讨论的试剂以外，试剂盒还包括一个或多个合适的容器、使用说明书、软件(例如，数据分析软件)等。在某些实施方案中，试剂盒包括用于标记多核苷酸的试剂。在某些实施方案中，试剂盒中的一种或多种组分呈冻干形式。本专利技术的实施方案提供了用于鉴别复杂生物样品（诸如痰或支气管肺泡灌洗液及其沉淀物）中的MTB的组合物、试剂盒、系统和方法。在某些实施方案中，所述组合物和方法提供了能够特异性地和准确地分离和鉴别MTB的灭活试剂和单个探针或多个探针实时检测方法。例如，在某些实施方案中，本专利技术提供了一种组合物，其包含：至少一个(例如，1、2或3个)选自SEQIDNO:1和2、SEQIDNO:3和4、或SEQIDNO:7和8的引物对。在某些实施方案中，所述组合物包含SEQIDNO:1-4和7-8。在某些实施方案中，所述组合物还包含至少一种选自SEQIDNO:5、6或9的探针。其它实施方案提供了一种组合物，其包含：SEQIDNO:1和2和SEQIDNO:3和4的引物对集合。在某些实施方案中，所述组合物还包含至少一种选自SEQIDNO:5、6或9的探针。在某些实施方案中，所述组合物还包含SEQIDNO:7和8的引物对。另外的实施方案提供了一种组合物，其包含SEQIDNO:1-9的每种核酸。在某些实施方案中，上本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种组合物，其包含：至少一个选自SEQ ID NO: 1和2、SEQ ID NO: 3和4、和SEQ ID NO: 7和8的引物对。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.07.24 US 62/0285271.一种组合物，其包含：至少一个选自SEQIDNO:1和2、SEQIDNO:3和4、和SEQIDNO:7和8的引物对。2.根据权利要求1的组合物，其中所述组合物包含SEQIDNO:1-4和7-8。3.根据权利要求1的组合物，其中所述组合物还包含至少一种选自SEQIDNO:5、6和9的探针。4.一种组合物，其包含：SEQIDNO:1和2和SEQIDNO:3和4的引物对集合。5.根据权利要求1的组合物，其中所述组合物还包含至少一种选自SEQIDNO:5、6和9的探针。6.根据权利要求4或5的组合物，其中所述组合物还包含SEQIDNO:7和8的引物对。7.一种组合物，其包含SEQIDNO:1-9的核酸。8.根据权利要求1-7中的任一项的组合物，其中列举的SEQIDNO中的一个或多个包含标记。9.根据权利要求8的组合物，其中所述标记包含荧光团。10.根据权利要求8的组合物，其中所述标记包含荧光团/猝灭剂对。11.根据权利要求1-10中的任一项的组合物，其中所述组合物还包含一个或多个选自SEQIDNO:10-36的核酸序列。12.根据权利要求1-11中的任一项的组合物，其中所述组合物是反应混合物。13.根据权利要求12的组合物，其中所述反应混合物包含样品。14.根据权利要求13的组合物，其中所述样品包含含有结核分枝杆菌(MTB)靶核酸的样品。15.一种试剂盒，其包含:a)根据权利要求1-11中的任一项所述的组合物；和b)至少一种用于执行核酸扩增反应的试剂。16.根据权利要求15的试剂盒，其中所述试剂选自核酸聚合酶；多种dNTPS、缓冲液和灭活试剂。17.根据权利要求16的试剂盒，其中所述灭活试剂包含水、去污剂、醇和NaOH。18.根据权利要求16的试剂盒，其中所述灭活试剂包含异丙醇、氢氧化钠、吐温-20和水。19.一种反应混合物，其包含一种或多种与结核分枝杆菌(MTB)核酸杂交的引物或探针，所述引物或探针包含SEQIDNO:1-9的序列。20.根据权利要求19的反应混合物，其中所述一种或多种引物或探针中的一种或多种包含标记。21.一种反应混合物，其包含与两种MTB靶序列:插入序列(IS)6110和蛋白抗原B(PAB)中的每一种杂交的一种或多种引物或探针。22.一种鉴别生物样品中的MTB核酸的方法，所述方法包括：a)使来自受试者的生物样品与SEQIDNO:1-9的核酸引物或探针接触，和b)检测所述核酸引物或探针与所述MTB核酸的结合。23.根据权利要求22的方法，所述方法另外包括下述步骤c)当检测到所述结合时，确定MTB在所述样品中的存在。24.根据权利要求22的方法，其中所述检测包括实时PCR。25.根据权利要求22的方法，其中所述方法还包括在所述接触之前使用灭活试剂灭活所述样品中的所述MTB的步骤。26.根据权利要求25的方法，其中所述灭活试剂包含水、去污剂、醇和NaOH。27.根据权利要求25的方法，其中所述灭活试剂包含异丙醇、氢氧化钠、吐温-20和水。28.根据权利要求22的方法，其中所述样品是痰。29.根据权利要求22的方法，其中所述样品是支气管肺泡灌洗液[BAL]。30.根据权利要求22的方法，其中所述样品是痰的N-乙酰基-L-半胱氨酸[NALC]沉淀物。31.根据权利要求25的方法，其中所述方法还包括在所述灭活以后从所述样品提取DNA的步骤。32.一种检测生物样品中的MTB核酸的方法，所述方法包括：a)用灭活试剂灭活所述生物样品以产生灭活的样品；b)从所述灭活的样品提取DNA；c)使所述DNA与以下物质接触：一个或多个引物对和一种或多种核酸探针；d)执行扩增测定以扩增一种或多种MTB核...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐宁，G勒基，V帕哈拉瓦塔，A弗兰克，J兰皮宁，
申请(专利权)人：雅培分子公司，
类型：发明
国别省市：美国,US