一种定量检测结核分枝杆菌r干扰素的化学发光试剂盒及其制备方法、检测方法、评价方法技术

本发明专利技术提供了一种定量检测结核分枝杆菌r干扰素的化学发光试剂盒及其制备方法、检测方法、评价方法，其中化学发光试剂盒包括血样刺激系统和免疫检测系统，所述血样刺激系统包括培养管、血样刺激用对照品、结核特异性刺激蛋白；所述免疫检测系统包括包被有r干扰素克隆抗体的化学发光板、生物素标记的r干扰素克隆抗体、链霉亲和素标记的酶底物和酶促发光底物，本发明专利技术采用酶促化学发光法，利用化学发光板中的r干扰素单克隆抗体或r干扰素多克隆抗体作为捕获抗体，以生物素标记的r干扰素单克隆抗体或r干扰素多克隆抗体作为检测抗体。提高了试剂盒的检测灵敏度和准确性，且便于大通量样本检测，也大大减少了样本使用量。

Chemiluminescence reagent kit for quantitative detection of Mycobacterium tuberculosis r interferon and its preparation method, detection method and evaluation method

The invention provides a chemical quantitative detection of Mycobacterium tuberculosis r interferon chemiluminescence kit and preparation method, evaluation method, detection method, the chemiluminescence kit includes blood stimulation system and immune detection system, the system including blood culture tube, blood stimulation stimulation, stimulation of Mycobacterium tuberculosis specific protein; the immune detection system includes packet by R chemical luminescence plate, interferon antibody r antibody and interferon streptavidin biotin labeled affinity enzyme substrate and enzyme labeled promoting substrate, the invention adopts the enzymatic chemiluminescence method, light emitting plate using chemistry R or R multi interferon interferon monoclonal antibody polyclonal antibody as the capture antibody, using biotin labeled r monoclonal antibody or interferon interferon r polyclonal antibody as detection antibody. The detection sensitivity and accuracy of the kit are improved, and the detection of large flux samples is convenient, and the amount of sample use is greatly reduced.

【技术实现步骤摘要】
一种定量检测结核分枝杆菌r干扰素的化学发光试剂盒及其制备方法、检测方法、评价方法
本专利技术涉及免疫分析
，具体涉及到一种定量检测结核分枝杆菌r干扰素的化学发光试剂盒及其制备方法、检测方法、评价方法。
技术介绍
结核病在全世界仍为危害人类健康和生命的主要传染病之一。目前全世界结核病患者约有2000万人，每年新增结核病患者800万人左右，每年因结核病死亡人数约300万人。我国仅次于印度，位居世界第二。通过近几年的流行病学抽样调查初步结果表明，我国约5亿人口感染结核分枝杆菌，现有结核病人约500万人，每年约10万人死亡于结核病，在我国传染病中位居第一。面对如此严峻的形势，结核病的预防和控制已经引起国内外政府和学者的高度重视。因此结核病的早期诊断和治疗对结核病控制尤为重要。机体对结核分枝杆菌的免疫应答主要体现为细胞免疫。因此对于结核分枝杆菌的检测只有通过对细胞免疫应答进行，近年来，一种用于诊断结核分枝杆菌的新方法进入人们视线，其利用特异性刺激蛋白对已感染结核杆菌的细胞进行刺激培养，机体细胞会分泌大量的r干扰素，利用免疫手段对分泌的特异性的r干扰素进行检测，间接的体现机体细胞的结核分枝杆菌的受感染情况，该检测原理被称为r干扰素释放试验(IGRA)技术。在该检测原理基础上衍生出了多种检测方法学，目前市场上所拥有的包括酶联免疫斑点(ELISPOT)法、酶联免疫(ELISA)法。ELISPOT检测的检测灵敏度较高，但因该检测方法在抽取病人血样后需要做淋巴细胞分离计数后再进行后期的刺激培养过夜及免疫检测程序，操作复杂，专业门槛较高，大大限制了检测通量，另外因其涉及的配套设备和试剂较多，也大大增加了检测成本及操作过程中的错误率发生。ELISA检测因使用全血培养，节省了较多操作时间，在检测通量上也弥补了ELISPOT的缺陷，但因为检测方法学的限制，其检测灵敏度较低，对于低免疫力或淋巴细胞数量偏低的人群，其检测结果的不确定性较高，无法做到精确的诊断，且因其检测低灵敏度的原因，所需检测血样量也较高，需要不低于每个培养管1ml的血量。
技术实现思路
为了解决上述不足的缺陷，本专利技术提供了一种定量检测结核分枝杆菌r干扰素的化学发光试剂盒及其制备方法、检测方法、评价方法，可以实现检测灵敏度高、特异性好、操作简便，检测通量高，检测成本低，检测样本量少且不需要太多复杂的辅助设备。本专利技术提供了一种定量检测结核分枝杆菌r干扰素的试剂盒，包括血样刺激系统和免疫检测系统，所述血样刺激系统包括培养管、血样刺激用对照品、结核特异性刺激蛋白；所述免疫检测系统包括包被有r干扰素克隆抗体的化学发光板、生物素标记的r干扰素克隆抗体、链霉亲和素标记的酶底物和酶促发光底物。上述的试剂盒，其中，所述血样刺激用对照品包括血样刺激用阴性对照品和血样刺激用阳性对照品；所述包被有r干扰素克隆抗体的化学发光板包括包被有r干扰素单克隆抗体或r干扰素多克隆抗体的化学发光板；所述生物素标记的r干扰素克隆抗体包括生物素标记的r干扰素单克隆抗体或r干扰素多克隆抗体；所述链霉亲和素标记的酶底物包括辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。上述的试剂盒，其中，所述血样刺激用阴性对照品中包括AIM-V培养液。上述的试剂盒，其中，所述结核特异性刺激蛋白包括AIM-V培养液和结核分枝杆菌特异性刺激蛋白ESAT6和CFP10的独立蛋白混合或ESAT6和CFP10融合蛋白。上述的试剂盒，其中，所述血样刺激用阳性对照品中包括AIM-V培养液、磷酸盐缓冲液、植物血凝素或CD3细胞因子。上述的试剂盒，其中，所述生物素标记的r干扰素单克隆抗体或r干扰素多克隆抗体的缓冲液为磷酸盐缓冲液和蛋白保护剂。上述的试剂盒，其中，所述链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的缓冲液为磷酸盐缓冲液和蛋白保护剂。同时在另一种实施例中，本专利技术还提供了一种定量检测结核分枝杆菌r干扰素的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：r干扰素单克隆抗体或多克隆抗体包被化学发光板的制备；生物素标记的r干扰素单克隆抗体或r干扰素多克隆抗体及工作夜的制备；链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶及工作液的制备；校准品的制备；洗涤液的制备。本专利技术的另一面，本专利技术还提供了一种定量检测结核分枝杆菌r干扰素的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：血样培养；r干扰素检测。本专利技术的再一面，本专利技术还提供了一种定量检测结核分枝杆菌r干扰素的试剂盒的评价方法，包括以下步骤：根据试剂盒的检测结果绘制标准曲线；根据上述的标准曲线计算最低检出限和精密性值；根据上述最低检出限和精密性值来判定检测样本的阴阳性。本专利技术具有以下优点：采用酶促化学发光法，将r干扰素单克隆抗体或r干扰素多克隆抗体包被于化学发光板中，利用酶促催化发光底物，并利用生物素放大系统，提高了试剂盒的灵敏度和准确性；同时对于样本使用量为3.0ml以下；实验证明，化学发光法配合生物素放大系统是一种检测r干扰素的有效方法，且进一步证明了对3.0ml以下的血样量的检测结果也有效的符合于临床评判。具体优点包括：1、化学发光法配合生物素放大系统检测系统，对于T淋巴细胞偏少的样本的检测结果与市面上ELISA试剂盒做了比对，本专利技术试剂盒的检测灵敏度明显高于ELISA试剂盒，能够对ELISA检测结果不确定的样本，做出很好的结果判断；2、本专利技术试剂盒在血样处理上，没有T淋巴细胞分离过程，为全血直接培养，在此操作上与市面上的ELISPOT试剂盒比较，减少了操作程序，避免了更多的操作失误，也节省了更多的操作时间，降低了操作所需试剂耗材的成本损耗；且因本专利技术试剂盒无需做太多血样处理，操作简便，对于所需设备也无很高要求，可实现大通量检测，免疫诊断部分可实现半自动化或全自动化批量操作。3、目前市场上的ELISA试剂盒所需样本量为3ml以上；ELISPOT试剂盒所需样本量为5ml以上，对于低免疫人群的样本量需求更高，甚至达到8-10ml，本专利技术试剂盒对于血样样本量的最高要求仅为3.0ml，大大减少了病人的血样抽取量。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本专利技术及其特征、外形和优点将会变得更明显。在全部附图中相同的标记指示相同的部分。并未刻意按照比例绘制附图，重点在于示出本专利技术的主旨。图1为本专利技术提供的化学发光检测试剂盒的标准曲线。具体实施方式在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本专利技术更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员而言显而易见的是，本专利技术可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本专利技术发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。为了彻底理解本专利技术，将在下列的描述中提出详细的步骤以及详细的结构，以便阐释本专利技术的技术方案。本专利技术的较佳实施例详细描述如下，然而除了这些详细描述外，本专利技术还可以具有其他实施方式。本专利技术提供了一种定量检测结核分枝杆菌r干扰素的试剂盒，包括血样刺激系统和免疫检测系统，所述血样刺激系统包括培养管、血样刺激用对照品、结核特异性刺激蛋白；所述免疫检测系统包括包被有r干扰素克隆抗体的化学发光板、生物素标记的r干扰素克隆抗体、链霉亲和素标记的酶底物和酶促发光底物。其中培养管中血样需求量在1.0ml及以下，也即每个检测样本量所需样本量在3ml以下，目前市场上的ELISA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种定量检测结核分枝杆菌r干扰素的试剂盒，其特征在于，包括血样刺激系统和免疫检测系统，所述血样刺激系统包括培养管、血样刺激用对照品、结核特异性刺激蛋白；所述免疫检测系统包括包被有r干扰素克隆抗体的化学发光板、生物素标记的r干扰素克隆抗体、链霉亲和素标记的酶底物和酶促发光底物。

【技术特征摘要】
1.一种定量检测结核分枝杆菌r干扰素的试剂盒，其特征在于，包括血样刺激系统和免疫检测系统，所述血样刺激系统包括培养管、血样刺激用对照品、结核特异性刺激蛋白；所述免疫检测系统包括包被有r干扰素克隆抗体的化学发光板、生物素标记的r干扰素克隆抗体、链霉亲和素标记的酶底物和酶促发光底物。2.如权利要求1所述的一种定量检测结核分枝杆菌r干扰素的试剂盒，其特征在于，所述血样刺激用对照品包括血样刺激用阴性对照品和血样刺激用阳性对照品；所述包被有r干扰素克隆抗体的化学发光板包括包被有r干扰素单克隆抗体或r干扰素多克隆抗体的化学发光板；所述生物素标记的r干扰素克隆抗体包括生物素标记的r干扰素单克隆抗体或r干扰素多克隆抗体；所述链霉亲和素标记的酶底物包括辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。3.如权利要求2所述的一种定量检测结核分枝杆菌r干扰素的试剂盒，其特征在于，所述血样刺激用阴性对照品中包括AIM-V培养液。4.如权利要求1所述的一种定量检测结核分枝杆菌r干扰素的试剂盒，其特征在于，所述结核特异性刺激蛋白包括AIM-V培养液和结核分枝杆菌特异性刺激蛋白ESAT6和CFP10的独立蛋白混合或ESAT6和CFP10融合蛋白。5.如权利要求2所述的一种定量检测结核分枝杆菌r干扰素的试剂盒，其特征在于，所述血样刺激用...

【专利技术属性】
技术研发人员：辛鑫，郜恒骏，张小燕，陈志明，牟晓庆，
申请(专利权)人：上海芯超生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31