结核分枝杆菌特异性CTL表位多肽及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种结核分枝杆菌特异性CTL表位多肽及其应用，属于分子生物学和免疫学领域，通过生物信息学软件的预测、HLA‑A2限制性CTL表位的选择、部分表位多肽的改造、表位多肽的合成及活性比较、筛选，得到结核分枝杆菌蛋白Rv2629的4条9肽的HLA‑A2限制性CTL表位Rv2629‑p190‑2L、Rv2629‑p190‑1Y2L、Rv2629‑p274和/或Rv2629‑p315，具有较高的亲和力并具有较高的稳定性；诱导结核病患者PBMCs产生的IFN‑γ水平显著高于正常对照组和结核潜伏感染组；刺激结核病组患者PBMCs生成分泌IFN‑γ的CTL的能力也显著高于正常对照组、结核潜伏感染组；均能诱导产生对靶细胞具有杀伤活性的CTL，其杀伤活性随着效靶比的增加而相应的提高；改造肽Rv2629‑p190‑2L和Rv2629‑p190‑1Y2L刺激生成的CTL均能识别其母肽Rv2629‑p190。本发明专利技术可作为结核病细胞免疫诱导剂，成为新型的抗结核表位疫苗或免疫诊断试剂的候选表位。

Mycobacterium tuberculosis specific CTL epitope polypeptide and uses thereof

The invention relates to a Mycobacterium tuberculosis specific CTL epitope polypeptide and application thereof, which belongs to the field of molecular biology and immunology, through bioinformatics software prediction, HLA A2 restricted CTL epitopes, epitope peptide modification, epitope peptide synthesis and activity comparison and screening of Mycobacterium tuberculosis coli protein Rv2629 4 9 peptides HLA A2 restricted CTL epitopes of Rv2629 P190 2L, Rv2629 1Y2L, Rv2629 P190 p274 and / or Rv2629 P315, with high affinity and high stability; the level of IFN gamma induced PBMCs TB patients produced significantly higher than that in normal control group and latent tuberculosis infection group; tuberculosis patients PBMCs ability to stimulate the secretion of IFN gamma CTL generation was significantly higher than normal control group, latent tuberculosis infection group; can induce to kill target cells The killing activity of CTL, the cytotoxic activity of effector target ratio increases with a corresponding increase P190; transformation peptide Rv2629 2L and Rv2629 P190 1Y2L stimulation generated CTL can identify its parent peptide Rv2629 p190. The invention can be used as an immunity inducer for tuberculosis cells and become a candidate epitope of a new anti tuberculosis epitope vaccine or an immune diagnostic reagent.

【技术实现步骤摘要】
结核分枝杆菌特异性CTL表位多肽及其应用
本专利技术涉及一种表位多肽及其应用，具体涉及一种结核分枝杆菌蛋白(Rv2629)特异性细胞毒性T淋巴细胞(CytotoxicTlymphocyte，CTL)表位多肽及其应用，这些表位多肽能够引起结核病患者特异性细胞免疫应答，在结核病免疫诊断试剂及表位疫苗研发方面具有应用价值，属于分子生物学和免疫学领域。
技术介绍
结核病是重要的公共卫生问题，是全世界范围内威胁人类健康的主要传染性疾病之一，具有发病率高和病死率高的特点。艾滋病的流行、排菌结核病患者的流动和部分人群生活贫困等原因使结核病发病率呈回升趋势，尤其是结核分枝杆菌耐药、与人类免疫缺陷病毒共感染等问题使结核病治疗更是雪上加霜。结核诊断标志物的发现及新型结核病预防或治疗性疫苗的研发成为当前结核病控制的主要研究方向。卡介苗(BCG)是目前唯一用于结核病预防的疫苗，但有研究表明，卡介苗仅对预防幼儿血行播散型结核、结核性脑膜炎等重症结核有意义，但对于成人肺结核及潜伏感染者无明显的保护作用，因此研究新型抗结核疫苗来取代或加强卡介苗的作用对于结核病的控制具有重要意义。目前新型抗结核疫苗的类型主要有：活疫苗(如重组BCG)、亚单位疫苗(包括蛋白疫苗、表位疫苗、DNA疫苗等)、灭活疫苗等。与其他形式的抗结核疫苗相比，表位疫苗具有如下特点：①能够大规模合成纯度高、重复性好的多肽，成分单一、化学性质稳定，有利于获得特异的抗结核免疫；②去除天然抗原中的有害成分，包括致病相关肽段、自身交叉免疫反应原等；③可以对多肽的氨基酸残基组成进行理性设计，强化所需要的免疫应答，从而增强疫苗的功能和效应。随着生物信息学的发展以及人们对抗原表位与MHC-Ⅰ类分子结合特性及MHC类抗原递呈途径认识的不断深入，涌现出许多预测表位的生物信息学手段。表位预测能极大的提高基于抗原表位的多肽疫苗设计的效率，增强实验的目的性，从而提高表位多肽疫苗研发的成功率。1998年结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，M.tb)标准株H37Rv的全基因组测序工作的完成，为结核表位多肽疫苗的研究提供了极好的机遇。由此可见，首先通过生物信息学方法进行抗原表位预测，然后进一步应用生物化学、免疫学以及微生物学的方法加以验证，大大加快了寻找表位抗原的效率。2012年6月27日公开的，专利申请号为CN201110362902.6，专利技术名称为“可用于结核分枝杆菌感染检测的表位多肽及其应用”的中国专利技术专利公开了几种结核分枝杆菌特异性抗原表位多肽，特别是抗原Rv3615c的抗原表位多肽，为8-11个连续的多肽片段，该抗原多肽虽然可以在结核患者中产生T细胞反应，但是这些多肽没有MHC分型，也没有进行CTL表位鉴定，在用做结核疫苗方面的特点并不明确，其亲和力、稳定性有待鉴定，体外免疫活性有待改进。Rv2629蛋白是一种结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白，由Voskuil等利用基因芯片技术在缺氧条件所致的结核分枝杆菌潜伏感染模型中发现。Joakim等应用比较蛋白质组学分析方法也发现缺氧条件下的结核分枝杆菌荷兰株的Rv2629蛋白的表达量增加。Desta等在体外用多种结核分枝杆菌蛋白抗原刺激活动性结核患者全血，结果发现Rv2629蛋白能刺激活动性结核患者外周血淋巴细胞释放高浓度的γ-干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和白介素-10(IL-10)，具有良好的效应T细胞诱导能力，有望成为新型的候选疫苗及结核潜伏感染诊断标志物。因此，提供一种具有较好的免疫原性，可诱导结核病患者特异性细胞免疫应答，可能成为新型的更有效的抗结核表位疫苗或免疫诊断试剂就成为该
急需解决的技术难题。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种具有较好的免疫原性，可诱导结核病患者特异性细胞免疫应答，可能成为新型的更有效的抗结核表位疫苗或免疫诊断试剂的特异性CTL表位多肽。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案达到的：一种用于结核分枝杆菌检测的特异性CTL表位多肽，其氨基酸序列如SEQNO.1，SEQNO.4，SEQNO.10，SEQNO.12所示。本专利技术的另一目的是提供一种上述表位多肽在制备结核分枝杆菌特异性CTL检测试剂盒中的应用。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案达到的：氨基酸序列如SEQNO.1，SEQNO.4，SEQNO.10，SEQNO.12所示特异性CTL表位多肽在制备结核分枝杆菌特异性CTL检测试剂盒中的应用。本专利技术的另一目的是提供一种含有上述表位多肽的结核分枝杆菌特异性CTL检测试剂盒。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案达到的：一种结核分枝杆菌特异性CTL检测试剂盒，其特征在于含有氨基酸序列如SEQNO.1，SEQNO.4，SEQNO.10，SEQNO.12所示特异性CTL表位多肽。本专利技术的另一目的是提供一种上述表位多肽在制备新型结核病疫苗中的应用。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案达到的：所述的表位多肽在制备新型结核病疫苗中的应用。本专利技术的另一目的是提供一种新型结核病疫苗。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案达到的：一种新型结核病疫苗，其特征在于含有氨基酸序列如SEQNO.1，SEQNO.4，SEQNO.10和/或SEQNO.12所示特异性CTL表位多肽。有益效果：本专利技术通过生物信息学软件的预测、HLA-A2限制性CTL表位的选择、部分表位多肽的改造、表位多肽的合成及活性比较、筛选，专利技术结核分枝杆菌蛋白Rv2629的4条9肽的HLA-A2限制性CTL表位Rv2629-p190-2L、Rv2629-p190-1Y2L、Rv2629-p274和Rv2629-p315可作为结核病细胞免疫诱导剂，成为新型的抗结核表位疫苗或免疫诊断试剂的候选表位，而目前尚无该种疫苗或检测试剂。本专利技术人研究证明这4个多肽Rv2629-p190-2L、Rv2629-p190-1Y2L、Rv2629-p274和Rv2629-p315是HLA-A2限制性CTL表位，与HLA-A2分子有较高的亲和力并具有较高的稳定性；诱导结核病患者PBMCs产生的IFN-γ水平显著高于正常对照组和结核潜伏感染组；刺激结核病组患者PBMCs生成分泌IFN-γ的CTL的能力也显著高于正常对照组、结核潜伏感染组；4个HLA-A2限制性表位多肽均能诱导产生对靶细胞具有杀伤活性的CTL，诱导产生的CTL的杀伤活性随着效靶比的增加而相应的提高；改造肽Rv2629-p190-2L和Rv2629-p190-1Y2L刺激生成的CTL均能识别其母肽Rv2629-p190。下面通过附图和具体实施方式对本专利技术做进一步说明，但并不意味着对本专利技术保护范围的限制。附图说明图1-1为本专利技术候选表位诱导健康组人群CTL细胞分泌IFN-γ水平。图1-2为本专利技术候选表位诱导潜伏感染者组人群CTL细胞分泌IFN-γ水平。图1-3为本专利技术候选表位诱导结核感染者组人群CTL细胞分泌IFN-γ水平。图2-1为本专利技术LDH法检测候选表位Rv2629-p190-2L诱导生成的CTL细胞的细胞毒性结果。图2-2为本专利技术LDH法检测候选表位Rv2629-p190-1Y2L诱导生成的CTL细胞的细胞毒性结果。图2-3为本专利技术LDH法检测候选表位Rv2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于结核分枝杆菌检测的特异性CTL表位多肽，其氨基酸序列如SEQ NO.1，SEQ NO.4，SEQ NO.10和/或SEQ NO.12所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于结核分枝杆菌检测的特异性CTL表位多肽，其氨基酸序列如SEQNO.1，SEQNO.4，SEQNO.10和/或SEQNO.12所示。2.权利要求1所述的表位多肽在制备结核分枝杆菌特异性CTL检测试剂盒中的应用。3.一种结核分枝杆菌特异性CTL检测试剂盒，其特征在于含有氨基酸序列如SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴雪琼，白雪娟，王东方，林明贵，刘银萍，梁艳，阳幼荣，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三〇九医院，
类型：发明
国别省市：北京,11