用于特异性检测结核分枝杆菌感染的蛋白制造技术

本发明专利技术公开了用于特异性检测结核分枝杆菌感染的蛋白。本发明专利技术提供了Rv0054蛋白在制备检测或辅助检测结核分枝杆菌产品中的应用；所述Rv0054是如下a)或b)的蛋白：a)序列表中的序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中的序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列1所示蛋白具有相同功能的由a)衍生的蛋白质。本发明专利技术的实验证明，能够更有效的提高结核分支杆菌感染检出率。

Proteins used for specific detection of Mycobacterium tuberculosis infection

The present invention discloses a protein for the specific detection of Mycobacterium tuberculosis infection. The invention provides a preparation of Rv0054 protein detection or auxiliary detection of Mycobacterium tuberculosis in the product in the system; the Rv0054 is as follows: a) or b) protein: a) amino acid sequence in the sequence table 1 shows the protein; b) amino acid residue sequence in the sequence 1 after one or several amino acid residues substitution and deletion and / or add with the same function and shown in sequence 1 protein derived protein by a). The experiment of the invention proves that the detection rate of Mycobacterium tuberculosis infection can be more effectively improved.

【技术实现步骤摘要】
用于特异性检测结核分枝杆菌感染的蛋白
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及用于特异性检测结核分枝杆菌感染的蛋白。
技术介绍
我国体外诊断产业现正处于快速增长时期。然而巨大的市场需求与我国诊断试剂行业相对落后的自主研发能力存明显的差距。如何从源头上开展自主创新，如何在诊断试剂原材料供应上不受制于个别境外医药巨头，如何将现有的生物医药领域的科研成果转化为产品是我国政府、科研院所和医药行业在近年来都非常关注的热点。并且现今市场上对更灵敏、高效的诊断试剂提出了刚性需求，能够快速准确的确诊结核病患者对于医务工作者和病人本人都具有重要意义。近年来数据调查结果显示，有结核病症状的患者76.6％接受过结核病病前相关检查，但是仅有35.8％被诊断为肺结核患者，提高病人发现率仍是当前结核病防治工作的重点也是难点。利用抗原特异性T细胞的细胞免疫反应进行病原微生物感染的体外诊断，是近年发展起来的一种新的检测方法。通过分离新鲜全血中的外周血单核细胞并进行刺激培养，然后利用ELISPOT检测能够分泌IFN-γ的细胞的数量。该方法目前主要应用于结核分枝杆菌感染的诊断。目前临床普遍采用的结核诊断主要依赖于临床症状、影响学诊断和病原学诊断，对结核分枝杆菌潜伏性感染的诊断不敏感。同时，在结核病筛查过程中，直接检测病原体或检测结核分枝杆菌抗体的灵敏度和特异性也不理想。T-SPOT.TB是一种更简单的酶联免疫斑点(ELISPOT)检测方法。ELISPOT检测是高灵敏度的，在细胞分泌的细胞因子扩散稀释前，其能够立即捕获细胞周围所分泌的细胞因子。这使得ELISPOT检测更加的灵敏，超过传统的ELISA实验。T-SPOT.TB被设计出来用于检测结核特异抗原刺激活化的效应T细胞。T-SPOT.TB记数每个活化的结核特异效应T细胞。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供Rv0054蛋白的用途。本专利技术提供Rv0054蛋白在制备检测或辅助检测结核分枝杆菌产品中的应用；所述Rv0054是如下a)或b)的蛋白：a)序列表中的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中的序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列2所示蛋白具有相同功能的由a)衍生的蛋白质。上述Rv0054蛋白在制备检测或辅助检测待测患者是否感染结核分枝杆菌产品中的应用也是本专利技术保护的范围。本专利技术的另一个目的是提供一种检测或辅助检测待测样本是否感染结核分枝杆菌的产品。本专利技术提供的产品，包括Rv0054蛋白。上述产品还包括阳性质控和空白对照；所述阳性质控为植物血凝素PHA；所述空白对照为无抗原的细胞培养液。上述产品中，所述产品还包括记载如下内容的可读载体：若空白对照孔和检测孔的斑点数符合如下标准：空白对照孔的斑点数为0-5个，且检测孔的斑点数-空白对照孔的斑点数≥5，则待测样本感染或候选感染结核分枝杆菌；若空白对照孔和检测孔的斑点数不符合上述标准，则待测样本未感染或候选未感染结核分枝杆菌；所述空白对照孔为空白对照所在孔，所述检测孔为所述Rv0054蛋白所在孔。上述产品为试剂盒，上述试剂盒具体为T-SPOT试剂盒，也可以为ELISA试剂盒。上述T-SPOT试剂盒还包括T-SPOT试剂盒中的微孔培养板、浓缩标记抗体、显色底物溶液。上述试剂盒为Oxfordimmunotec(英国)的产品。本专利技术第三个目的是提供一种用于鉴别、诊断、辅助诊断、筛查和/或辅助筛查结核分枝杆菌的标志物。本专利技术提供的标志物，为Rv0054蛋白。本专利技术的实验证明，本专利技术筛选了结核分枝杆菌来源的蛋白片段，提供了一种检测结核病的结核分枝杆菌标识物抗原RV0054，通过该抗原来体外检测特异性T细胞免疫反应，可以作为诊断结核病患者的参照，用于诊断患者是否被结核分枝杆菌感染。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。部分试剂如下：lysisbuffer：20mMTris-HCl、500mM氯化钠、10％甘油、pH8.0Washbuffer：20mMTris-HCl、20mM咪唑、500mM氯化钠、10％甘油、pH8.0Elutionbuffer：20mMTris-HCl、250mM咪唑、500mM氯化钠、10％甘油、pH8.0层析缓冲液：取磷酸二氢钾13.609g(配制1000ml)，加0.1mol/l氢氧化钠溶液，调节pH至7.5，得到pH值为7.5的PBS缓冲液。固化Ni+层析树脂Novagen，Ni-NTAHis，(Cat.NO70691-5，北京华美；2-8度保存)；蛋白结合能力大于5mg/mlresin层析柱(玻璃或者聚丙烯)。superdex75：(GE)。下述实施例采用结核感染T细胞检测试剂盒是Oxfordimmunotec(英国)的T-SPOT试剂盒，为ESAT-6和CFP10双抗原试剂盒。实施例1、原核表达目的蛋白Rv0054目的蛋白Rv0054的制备：将表达Rv0054蛋白编码基因的重组载体pET28a-Rv0054导入大肠杆菌BL21中，得到重组菌BL21/pET28a-Rv0054；再IPTG诱导重组菌BL21/pET28a-Rv0054，收集上清液，即为目的蛋白Rv0054。具体如下：1、表达目的蛋白重组菌的构建Rv0054蛋白的氨基酸序列为序列2，其编码基因的核苷酸序列为序列1。将序列1所示的Rv0054蛋白编码基因插入pET28a载体的NdeI和EcoRI位点，得到重组载体pET28a-Rv0054；将重组载体导入大肠杆菌BL21中，得到重组菌BL21/pET28a-Rv0054。2、蛋白表达1)重组菌BL21/pET28a-Rv0054在37℃静置过夜(16h左右)。2)接种于5ml液体LB培养基(加入5ulkan)37℃200rpm，培养至OD大于0.6-0.8(大约3h)。3)按接种量5ml接种于300mlLB液体培养基中，37℃，200rpm培养至OD600≈0.6-0.8(大约2h)。降温到16℃，加入终浓度0.4mMIPTG；4)16℃，200rpm培养培养16h，4℃，4000rpm离心10min收集菌体。3、蛋白纯化1)菌体重悬：每1L培养基所收集的菌体用40ml左右lysisbuffer重悬(加入1％蛋白酶抑制剂PMSF，则终浓度为0.5-1mM)2)菌体破碎：超声6s/次、功率为38％，超声20min。(悬浊液透亮为标准，酌情调整超声工作总时间)。3)去除细菌碎片：4℃，12000g离心30分钟。4)Ni柱处理：3mlNi柱先用水处理8cv(8倍柱体积)，再用8cvlysisbuffer作为平衡液平衡，流速为30cm/h。5)上样：破菌离心上清以30cm/ml的流速进行上样，收集流穿峰。6)平衡：样品上样后用平衡液平衡5cv；7)洗涤：用washbuffer洗涤5cv；8)洗脱：用elutionbuffer洗脱，分管收集。用bradford试剂检测洗脱液，了解蛋白是否完全洗脱。如含有蛋白，则继续洗脱，直至完全，得到洗脱蛋白。9)透析：洗脱蛋白装入7KD的透析袋中放入装有100倍洗脱蛋白体积的离子交换缓冲液A(配方10mMPB、50mMNaCl、本文档来自技高网...

【技术保护点】
Rv0054蛋白在制备检测或辅助检测结核分枝杆菌产品中的应用；所述Rv0054是如下a)或b)的蛋白：a)序列表中的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中的序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列2所示蛋白具有相同功能的由a)衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.Rv0054蛋白在制备检测或辅助检测结核分枝杆菌产品中的应用；所述Rv0054是如下a)或b)的蛋白：a)序列表中的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中的序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列2所示蛋白具有相同功能的由a)衍生的蛋白质。2.Rv0054蛋白在制备检测或辅助检测待测患者是否感染结核分枝杆菌产品中的应用。3.一种检测或辅助检测待测样本是否感染结核分枝杆菌的产品，包括Rv0054蛋白。4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于：所述产品还包括阳性质控和空白对照；所述阳性质控为植物血凝素PHA；所述空白对照...

【专利技术属性】
技术研发人员：毕利军，张先恩，朱国峰，邓教宇，陶生策，侯剑，王雅果，
申请(专利权)人：广东体必康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44