牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡及其制备方法；旨在提供一种同时检测牛血清标本中的牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌，其检测时间短、稳定性好、操作简单、无需其他仪器和专业的人员，结果判断直观可靠；其技术要点包括：包括壳体(1)，所述壳体(1)上设有加样孔(2)和观察窗(3)，壳体(1)内设有胶体金试纸条，其特征在于,所述胶体金试纸条包括底板(4)，所述底板(4)上依次衔接有样品垫(5)、金标垫(6)、包被膜(7)和吸水垫(8)；所述的包被膜(7)上设有一条牛结核分枝杆菌膜蛋白MPB70‑MPB83检测线T1、一条牛布鲁士杆菌LPS检测线T2和羊抗兔多克隆抗体质控线C，该三条线平行排列；属于生物技术领域。

Mycobacterium bovis and Brucella abortus double detection card and preparation method thereof

The invention discloses a bovine Mycobacterium tuberculosis and Brucella abortus double detection card and preparation method thereof; and aims to provide a simultaneous detection of bovine serum samples of Mycobacterium tuberculosis and Brucella abortus, the short detection time, good stability, simple operation, no other equipment and professional personnel, intuitive judgment result is reliable including; the technical points include: (1) the housing, the housing (1) is provided with a sample adding hole (2) and an observation window (3), shell (1) is arranged in the colloidal gold strip, which is characterized in that the colloidal gold test strip comprises a bottom plate (4), the bottom (4) in connection with a sample pad (5), the gold standard pad (6), a coating film (7) and absorbent pad (8); the coating film (7) is provided with a membrane protein MPB70 of Mycobacterium tuberculosis MPB83 detection line T1, a cow Bruce coli LPS the detection line T2 and Goat anti rabbit The clone antibody quality control line C, the three lines are arranged in parallel, and belong to the technical field of biology.

【技术实现步骤摘要】
牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡及其制备方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡及其制备方法。
技术介绍
牛结核病是由牛结核分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)引起的一种人畜共患的慢性消耗性传染病的人畜共患传染病。会对奶牛业和人畜的健康造成严重危害。牛布鲁氏病是由牛种布鲁氏菌(B.abortus)引起的一种人畜共患慢性细菌性传染病。受感染的动物和人往往会导致生殖系统的损害，对人类的身心健康造成严重的威胁和对畜牧业造成巨大的经济损失。检测牛血清中牛结核杆菌或布鲁氏杆菌抗体是目前对牛结核病或牛布病免疫学血清诊断方法之一。中国专利CN200910218156.6和CN200610166551分别采用不同的牛结核杆菌蛋白抗原，用免疫胶体金卡条技术检测牛血清中的抗体。但这两种免疫胶体金卡只检测牛结核杆菌抗体。牛布病免疫学血清诊断方法有凝集试验、补体结合试验、ELISA、荧光偏振试验、乳环试验等。这些方法或需要特殊的仪器设备和专业人员操作，费时。而且用一种方法来检测时容易出现非特异性结果。中国专利CN201410266781.9，CN200910071636.4，CN200910071637.9和CN201110031816.7均为基于ELISA的检测方法，需要酶标仪和专业人员操作，耗时较长，相应的方法只能检测一种抗体。综上所述，牛结核病和牛布病都是商品肉牛和奶牛常见而且危害严重的疾病。目前在对牛结核和牛布病免疫血清学抗体检测领域的一些检测方法都是只针对一种疾病的检测。
技术实现思路
本专利技术的第一目个的是提供一种同时检测牛血清中牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌的胶体金双联检测卡及其制备方法，该检测卡可同时检测牛血清标本中的牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌，其检测时间短、稳定性好、操作简单、无需其他仪器和专业的人员，结果判断直观可靠。本专利技术的第二个目的是提供一种检测牛血清中牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌的胶体金双联检测卡的制备方法，其制备方法简单。为此，本专利技术提供的第一个技术方案是这样的：一种牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡，包括壳体，所述壳体上设有加样孔和观察窗，壳体内设有胶体金试纸条，其特征在于,所述胶体金试纸条包括底板，所述底板上依次衔接有样品垫、金标垫、包被膜和吸水垫；所述的包被膜上设有一条牛结核分枝杆菌膜蛋白MPB70-MPB83检测线T1、一条牛布鲁士杆菌LPS检测线T2和羊抗兔多克隆抗体质控线C，该三条线平行排列。进一步的，上述的一种牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡，所述包被膜两端分别与吸水垫和金标垫相互交叠连接，所述样品垫压贴在金标垫上。进一步的，上述的一种牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡，所述样品垫为玻璃纤维样品垫。进一步的，上述的一种牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡，所述底板为PVC板。进一步的，上述的一种牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡，所述包被膜为硝酸纤维素膜。本专利技术的第二个技术方案是这样的：该牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡的制备方法，依次包括下述步骤：在底板上依次衔接有样品垫、金标垫、包被膜和吸水垫得胶体金试纸条，将胶体金试纸条放置与壳体内；其中：一)牛布鲁氏杆菌脂多糖通过下述步骤制得：采用热酚水法提取粗牛布鲁氏杆菌脂多糖后，在0.01MpH7.4的PBS中透析48h，中间换透析液6次，透析完成后在脂多糖溶液中加入10ug/ml的DNA酶和10ug/ml的RNA酶，37℃孵育40min，加入15ug/ml的蛋白酶K37℃孵育1h，冷却，离心分离，收集上清，加入2倍体积无水乙醇，沉淀后即的牛布鲁氏杆菌脂多糖；三)MPB70-MPB83融合蛋白通过下述步骤制得：构建重组质粒pET70-83-C10-E6,将重组质粒pET70-83-C10-E6转化BL21细胞，将转化的细胞涂布于卡那霉素的LB琼脂平板上，挑单菌落于Kan+的LB液体培养基中，加IPTG至终浓度0.6mmol/l，继续振摇3h，离心收集菌，超声波裂解细菌，将蛋白上清用Ni-NTAHisBindPurificationKit(Ni-NTAHis融合标签蛋白纯化试剂)纯化，用紫外分光光度计测定蛋白浓度，纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳分析与设计的融合蛋白分子量符合，经ELISA测定后蛋白活性较好；三)兔抗牛抗体的制备以牛源抗体为免疫源免疫新西兰大白兔得到兔抗牛二抗；四)兔抗牛-胶体金复合物的制备(1)胶体金的制备在三角瓶中加100ml超纯水置恒温加热磁力搅拌器上加热至沸腾，加入1ml1％氯金酸溶液，重新沸腾后再加入1.6ml二水柠檬酸三钠，继续加热至沸腾后15min停止加热，恢复至室温后加入超纯水恢复至原体积，4℃保存备用；(2)兔抗牛-胶体金的复合物胶体金溶液在搅拌下用0.1mol/L的碳酸钾调节胶体金溶液pH至9.0，按每毫升胶体金溶液15微克的量缓慢加入浓度为1mg/ml的兔抗牛IgG，室温下继续搅拌50min，加入10％BSA溶液至终浓度为1％，室温下继续搅拌50min，搅拌停止后离心分离，收集沉淀，上层胶体金溶液在4℃，8500r/min离心30min收集沉淀，沉淀用复溶液按照标记胶体金体积的1/30复溶，4℃保存备用；五)金标垫的制备制备好的兔抗牛-胶体金复合物按3ul/cm的量喷于玻璃纤维上，37℃烘干3h后密封干燥保存备用；六)检测线，质控线的包被用0.01mol/LpH7.4的PBS溶液稀释融合蛋MPB70-MPB83至浓度2mg/ml，按1ul/cm的量划于硝酸纤维素膜上，用0.01mol/LpH为7.4的PBS溶液稀释牛布鲁氏杆菌脂多糖至浓度3mg/ml，按1ul/cm的量划于硝酸纤维素膜上，用0.01molpH为7.4的PBS溶液稀释羊抗兔IgG至1mg/ml，按1ul/cm的量划于硝酸纤维素膜上，三条线之间的间隔为5mm，包被后的膜于37℃干燥，密封保存备用；七)样品垫的制备将玻璃纤维置于样品垫处理液中浸泡5min后，于37℃干燥后密封保存备用。进一步的，上述的牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡的制备方法，所述的复溶液为20mMpH为9.0的Tris-HCl缓冲液，其中BSA含量为0.5％，吐温-20为0.3％，PVP-40为1％，进一步的，上述的牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡的制备方法，所述的样品垫处理液为50mmol/LpH9.0的Tris-HCl溶液，其中BSA的含量为0.1％，酪蛋白含量为0.5％，曲拉通-100的含量为0.3％，PVP-40的含量为1.5％。与现有技术相比，本专利技术提供的技术方案具有如下优点：1、本专利技术提供的胶体金检测卡与传统检测方法符合率高特异性好。采用本专利技术胶体金检测卡检测结核菌素皮内变态反应试验中，阳性的63阳性血清中检测有52份检测是阳性，符合率为83％。检测结核菌素皮内变态反应试验中阴性的78份血清中有70份为阴性，符合率为89％。同时本新型胶体金检测卡检测牛传染性鼻气管炎、牛口蹄疫、牛巴贝斯病阳性血清时均为阴性。2、本专利技术提供的胶体金检测卡与传统检测方法相比，操作简便，结果判读快速。实用检测卡时无需专业人员，也无需其他较贵的试剂，只需将检测血清用生理盐水稀释后滴入本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡，包括壳体(1)，所述壳体(1)上设有加样孔(2)和观察窗(3)，壳体(1)内设有胶体金试纸条，其特征在于,所述胶体金试纸条包括底板(4)，所述底板(4)上依次衔接有样品垫(5)、金标垫(6)、包被膜(7)和吸水垫(8)；所述的包被膜(7)上设有一条牛结核分枝杆菌膜蛋白MPB70‑MPB83检测线T1、一条牛布鲁士杆菌LPS检测线T2和羊抗兔多克隆抗体质控线C，该三条线平行排列。

【技术特征摘要】
1.一种牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡，包括壳体(1)，所述壳体(1)上设有加样孔(2)和观察窗(3)，壳体(1)内设有胶体金试纸条，其特征在于,所述胶体金试纸条包括底板(4)，所述底板(4)上依次衔接有样品垫(5)、金标垫(6)、包被膜(7)和吸水垫(8)；所述的包被膜(7)上设有一条牛结核分枝杆菌膜蛋白MPB70-MPB83检测线T1、一条牛布鲁士杆菌LPS检测线T2和羊抗兔多克隆抗体质控线C，该三条线平行排列。2.根据权利要求1所述的一种牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡，其特征在于，所述包被膜(7)两端分别与吸水垫(8)和金标垫(6)相互交叠连接，所述样品垫(5)压贴在金标垫(6)上。3.根据权利要求1所述的一种牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡，其特征在于，所述样品垫(5)为玻璃纤维样品垫。4.根据权利要求1所述的一种牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡，其特征在于，所述底板(4)为PVC板。5.根据权利要求1所述的一种牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡，其特征在于，所述包被膜(7)为硝酸纤维素膜。6.制备权利要求1所述的牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡，其特征在于，依次包括下述步骤：在底板(4)上依次衔接有样品垫(5)、金标垫(6)、包被膜(7)和吸水垫(8)制得胶体金试纸条，将胶体金试纸条放置与壳体(1)内；其中：一)牛布鲁氏杆菌脂多糖通过下述步骤制得：采用热酚水法提取粗牛布鲁氏杆菌脂多糖后，在0.01MpH7.4的PBS中透析48h，中间换透析液6次，透析完成后在脂多糖溶液中加入10ug/ml的DNA酶和10ug/ml的RNA酶，37℃孵育40min，加入15ug/ml的蛋白酶K37℃孵育1h，冷却，离心分离，收集上清，加入2倍体积无水乙醇，沉淀后即的牛布鲁氏杆菌脂多糖；二)MPB70-MPB83融合蛋白通过下述步骤制得：构建重组质粒pET70-83-C10-E6，将重组质粒pET70-83-C10-E6转化BL21细胞，将转化的细胞涂布于卡那霉素的LB琼脂平板上，挑单菌落于Kan+的LB液体培养基中，加IPTG至终浓度0.6mmol/l，继续振摇3h，离心收集菌，超声波裂解细菌，将蛋白上清用Ni-NTAHis融合标签蛋白纯化试剂纯化，用紫外分光光度计测定蛋白浓度，纯化后的蛋白经SD...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘海森，蒋永青，刘晶，张金超，黄振宇，
申请(专利权)人：深圳市绿诗源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44