一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法，包括如下步骤：取待检样品和金标抗体混合，将混合后的样品通过副结核分歧杆菌抗原所在的区域，观察副结核分歧杆菌抗原所在区域的显色情况，所述检测方法在胶体金试纸条上进行，且所述胶体金试纸条上依次设有用于放置待检样品的样品垫、设有金标抗体的胶体金结合垫和设有副结核分歧杆菌抗原的检测线，该检测方法具有较强的特异性与灵敏度，且检测成本低，方法便捷，适合在畜牧业（养牛）进行大力推广。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物抗体检测领域，具体涉及一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法。
技术介绍
副结核分歧杆菌是一种放线菌，它主要能引起家畜，尤其是牛（特别是乳牛）感染产生副结核病，它主要在牛肠道中繁殖，导致牛肠粘膜下层产生大量类上皮样细胞，使组织增生，增厚，形成皱褶，同时肠粘膜腺体受到压迫而致萎缩，从而使病畜消瘦，眼窝下陷，经常躺卧，营养高度不良，皮肤粗糙，被毛松乱，下颌及垂皮可见水肿，最后因全身衰弱死亡。因其有以上致病机理，副结核分歧杆菌对畜牧业发展有较大影响，而现有技术对该菌的检测手段有限。因此，开发出一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法具有较好的应用价值。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的是提供一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法。本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法，包括如下步骤：取待检样品和金标抗体混合，将混合后的样品通过副结核分歧杆菌抗原所在的区域，观察副结核分歧杆菌抗原所在区域的显色情况。采用上述方案，当样品里面含有副结核分歧杆菌抗体时，它会作为抗原与金标抗体发生特异性结合，形成副结核分歧杆菌抗体-二抗-金颗粒复合物A，当复合物A在通过副结核分歧杆菌抗原所在的区域时，这种复合物A中的副结核分歧杆菌抗体会与副结核分歧杆菌抗原发生特异性结合，形成副结核分歧杆菌抗原-副结核分歧杆菌抗体-二抗-金颗粒复合物B，当复合物B在副结核分歧杆菌抗原所在区域越聚越多时，该区域的金颗粒就会越聚越多从而使该区域变成肉眼可见的红色；若样品里面不含有副结核分歧杆菌抗体，则副结核分歧杆菌抗原所在的区域不会形成复合物B，该区域就不会发生金颗粒聚集的情况从而不会发生颜色变化；因此，可根据副结核分歧杆菌抗原所在的区域的颜色变化来定性检测出待检样品中是否含有副结核分歧杆菌抗体。作为优选，所述检测方法在胶体金试纸条上进行，且所述胶体金试纸条上依次设有用于放置待检样品的样品垫、设有金标抗体的胶体金结合垫和设有副结核分歧杆菌抗原的检测线。采用上述方案，胶体金试纸条可按恒定的标准来批量生产，其质量可控且稳定，从而减少试验过程中试验变量（如检测人员、环境或设备等）对检测结果的影响；其次，由于胶体金试纸条的批量生产，检测人员无须现配现做，从而降低检测劳动力和成本；另外，其小巧轻便，方便检测人员携带和使用。作为优选，所述胶体金试纸条由如下步骤制备得到：（1）制备样品垫：采用纤维素滤纸作为样品垫；（2）制备胶体金结合垫：将金标抗体喷在玻璃纤维上，室温烘干；（3）制备检测线：将偶联副结核分歧杆菌MAP1588C抗原-BSA用pH=7.4且浓度为0.01mol/L的PBS溶液稀释至0.4mg/ml，喷于硝酸纤维膜上，室温烘干；（4）组装：将按步骤（1）制备得到的样品垫、步骤（2）制备得到的胶体金结合垫和步骤（3）制备得到的硝酸纤维膜按顺序放置并固定在聚氯乙烯板上；（5）切片，将按步骤（4）组装好的聚氯乙烯板切割，即得。采用上述方案，纤维素滤纸可快速将样品完全吸收后向后面金标抗体所在的玻璃纤维进行扩散，带动金标抗体经过硝酸纤维膜上的检测线，硝酸纤维膜对MAP1588C抗原蛋白有很好的包被固定作用，抗原蛋白不会在硝酸纤维膜上发生移动，从而使显色反应范围固定成一条直线，便于观察，同时将包被的副结核分歧杆菌MAP1588C抗原-BSA浓度控制为0.4mg/ml，可以使检测线不会因为包被蛋白过多而出现“堵金”现象，也不会因为包被蛋白过少，而出现检测线结果较淡的情况。此外聚氯乙烯板可对整个试纸条起到支撑作用。同时由于胶体金试纸条是由不同构件组成，可将不同构件批量生产后组装，可确保检测效果批间稳定。作为优选，所述检测线上远离胶体金结合垫的一侧设有吸水纸，所述吸水纸设在胶体金试纸条上。采用上述方案，吸水纸与待检样品之间具有一定的吸力，其可促进待检样品向着吸水纸方向运动并依次通过胶体金结合垫和硝酸纤维膜，保证样品能完全经过检测线。作为优选，所述金标抗体由如下方法制备得到：（1）胶体金溶液的制备：取质量浓度为0.008-0.010%的氯金酸水溶液，加热至沸腾，立即加入质量浓度为0.08-0.1%的柠檬酸三钠水溶液；至溶液的颜色完全变为透明的酒红色时，停止加热并冷却至室温，低温贮存；其中所述氯金酸和柠檬酸三钠的质量用量比为1：3-4；（2）鼠抗牛IgG的制备：取牛血清IgG抗原混合弗氏不完全佐剂后免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠SP2/0骨髓瘤细胞和脾细胞进行融合；筛选出稳定分泌抗牛血清IgG单克隆抗体的阳性细胞株，然后注射细胞进小鼠体内诱生腹水；取2ml鼠抗牛IgG腹水加入4ml浓度为0.06mol/LpH5.0的乙酸缓冲液，用0.1mol/L的HCl调pH至4.5，于室温搅拌下逐滴缓慢加入辛酸；按每毫升稀释前的腹水加入33μl并搅拌，低温静置后低温离心，取上清液，上清液经过滤后加入1/10体积的PBS(pH7.4)，冰浴下加入0.277g/ml的硫酸铵，静置后低温离心，弃上清，沉淀溶于0.01mol/LPBS中进行透析；（3）金标抗体的制备：取步骤（1）制备的胶体金溶液，加入K2CO3调节其pH为8.2，搅拌均匀，缓慢滴加步骤（2）制备的鼠抗牛IgG溶液，搅拌条件下依次加入1%PEG和10%BSA溶液；搅拌均匀，低温低速离心取上清液低温高速离心，吸去上清后用缓冲液重悬沉淀；其中，所述胶体金和鼠抗牛IgG体积的比例为100:2-3。采用上述方案，在胶体金溶液的制备中，将氯金酸和柠檬酸三钠的质量用量比控制为1：3-4，可保证胶体金粒直径在40nm左右，形成均匀一致的胶体金溶液，从而可保证最终在试纸条上能产生足够的显色信号供检测人员辨认；在金标抗体的制备过程中，将胶体金和鼠抗牛IgG体积的比例控制为100:2-3，可保证与之结合的鼠抗牛IgG均匀包被，确保金标抗体的稳定性和特异性。作为优选，所述副结核分歧杆菌MAP1588C抗原由如下方法制备得到：从副结核分歧杆菌基因组中扩增出MAP1588C基因片段，插入原核表达载体pET-28b（＋），转化至大肠杆菌BL21（DE3），在0.5mmol/L的IPTG诱导下进行表达；利用融合蛋白的组氨酸标签进行亲和层析纯化重组蛋白。采用上述方案，PCR扩增的手段制作副结核分歧杆菌MAP1588C抗原蛋白，相比采用常规的细胞裂解法从副结核分歧杆菌分离出菌体蛋白，具有更高的特异性及灵敏度，可最大程度保证其抗原性。作为优选，所述待检样品的制备过程为：取待检牛血液1ml，于室温下自然凝集，然后分离血凝块并离心,取上层血清加入生理盐水即得所述待检样品，其中所述上层血清和生理盐水的体积比为1：4-5。采用上述方案，上层血清和生理盐水的体积比为1：4-5，可使血清稀释，可减弱血清中其他抗体与金标抗体之间的特异性反应，从而使检测线处的阳性反应更明显。作为优选，所述胶体金试纸条硝酸纤维膜上检测线和吸水纸之间设有用于放置兔抗鼠Ig本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：取待检样品和金标抗体混合，将混合后的样品通过副结核分歧杆菌抗原所在的区域，观察副结核分歧杆菌抗原所在区域的显色情况。

【技术特征摘要】
1.一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
取待检样品和金标抗体混合，将混合后的样品通过副结核分歧杆菌抗原所在的区域，观察副结核分歧杆菌抗原所在区域的显色情况。
2.根据权利要求1所述的一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法，其特征在于，所述检测方法在胶体金试纸条上进行，且所述胶体金试纸条上依次设有用于放置待检样品的样品垫、设有金标抗体的胶体金结合垫和设有副结核分歧杆菌抗原的检测线。
3.根据权利要求2所述的一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法，其特征在于，所述胶体金试纸条由如下步骤制备得到：
（1）制备样品垫：采用纤维素滤纸条作为样品垫；
（2）制备胶体金结合垫：将金标抗体喷在玻璃纤维上，室温烘干；
（3）制备检测线：将偶联副结核分歧杆菌MAP1588C抗原-BSA用pH=7.4且浓度为0.01mol/L的PBS溶液稀释至0.4mg/ml，喷于硝酸纤维膜上，室温烘干；
（4）组装：将按步骤（1）制备得到的样品垫、步骤（2）制备得到的胶体金结合垫和步骤（3）制备得到的硝酸纤维膜按顺序放置并固定在聚氯乙烯板上；
（5）切片，将按步骤（4）组装好的聚氯乙烯板切割，即得所述胶体金试纸条。
4.根据权利要求3所述的一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法，其特征在于，所述检测线上远离胶体金结合垫的一侧设有吸水纸，所述吸水纸设在胶体金试纸条上。
5.根据权利要求3所述的一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法，其特征在于，所述金标抗体由如下方法制备得到：
（1）胶体金溶液的制备：取质量浓度为0.008-0.010%的氯金酸水溶液，加热至沸腾，立即加入质量浓度为0.08-0.1%的柠檬酸三钠水溶液；至溶液的颜色完全变为透明的酒红色时，停止加热并冷却至室温，低温贮存；其中所述氯金酸和柠檬酸三钠的质量用量比为1：3-4；
（2）鼠抗牛IgG的制备：取牛血清IgG抗原混合弗氏不完全佐剂后免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠SP2/0骨髓瘤细胞和脾细胞进行融合；筛选出稳定分泌抗牛血清IgG单克隆抗体的阳性细胞株，然后注射细胞进小鼠体内诱生腹水；取2ml鼠抗牛IgG腹水加入4ml浓度为0.06mol/LpH5.0的乙酸缓冲液，用0.1mol/L的HCl调pH至4.5，于室温搅拌下逐滴缓慢加入辛酸；按每...

【专利技术属性】
技术研发人员：代兵，刘秀婷，郭春景，马艳粉，刘颖，
申请(专利权)人：杭州国正检测技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33