一种山羊伪结核杆菌抗体的ELISA检测试剂盒的制备方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，提供一种山羊伪结核杆菌抗体的ELISA检测试剂盒的制备方法。本发明专利技术以完整的伪结核棒状杆菌菌体作为包被抗原，建立间接ELISA检测方法，检测血清中是否含有抗伪结核棒状杆菌抗体，判断山羊是否感染伪结核。本发明专利技术确定了阴阳性临界值，具有很高的特异性和重复性，能够快速有效的检测出山羊血清中的伪结核抗体，可用于山羊伪结核诊断、流行病学调查。

【技术实现步骤摘要】
一种山羊伪结核杆菌抗体的ELISA检测试剂盒的制备方法一、
：本专利技术涉及伪结核棒状杆菌的检测
，具体涉及一种山羊伪结核杆菌抗体的ELISA检测试剂盒的制备方法。二、
技术介绍
：山羊干酪性淋巴结炎（CaseousLymphadenitis，CLA）（又称山羊伪结核）是由伪结核棒状杆菌(Corynebacteriumpseudotuberculosis，C.p)引起的以淋巴结肿大为主要特征的一种慢性人兽共患病，主要感染山羊和绵羊，分为体表型和内脏型两种。患病畜及隐性感染动物可通过鼻分泌物、排泄物以及破溃的脓肿流出的浓汁向外界排放大量的病原体，病原体通过直接或间接接触感染健康羊只并造成土壤、水、食物、牧草地的污染。患病羊产奶量下降、产毛量减少、繁殖能力减弱，在食欲不明显减退的情况下逐渐消瘦，生产力下降的同时能源消耗不减，不仅增加了养殖成本，还引发羊肉、羊奶鲜乳等动物性食品病原微生物及兽药残留严重超标，带来食品安全隐患。临床上对体表型脓包病羊通常可以采取治疗或淘汰措施，但内脏型患病羊只无明显临床症状，较难及时发现采取相应措施。因此，内脏型患病羊只的有效诊断对于该病的防控十分重要。目前，对于该病的病原学诊断方法有病原菌的分离培养与生化鉴定、协同溶血试验、PCR，但这些方法基本不适用于内脏型患羊的活体诊断。鉴于国内目前尚无伪结核疫苗，而患病羊血清中必然存在抗伪结核棒状杆菌抗体，因此，ELISA检测方法检测其抗体水平可有效反映羊只的感染情况。目前，间接ELISA方法检测山羊伪结核抗体所用的包被抗原包括原核表达PLD蛋白、超声裂解的菌体蛋白。以原核表达的PLD蛋白做包被抗原时，特尔异性较差，会与其他疫病阳性血清发生交叉反应。以超声裂解的菌体作为包被抗原时，不同批次裂解菌体所得结果差异较大，不能保证批次间的稳定性；且菌体裂解，释放内部蛋白，易出现假阳性检测结果。本专利技术以完整山羊伪结核棒状杆菌菌体作为包被抗原，检测结果特异性强，且重复性好，避免了上述两种包被抗原造成的缺陷。三、
技术实现思路
：本专利技术为了解决上述
技术介绍
中的不足之处，提供一种山羊伪结核杆菌抗体的ELISA检测试剂盒的制备方法，该方法操作简单，检测结果灵敏稳定，适用于大批量样本检测。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种山羊伪结核杆菌抗体的ELISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述的制备方法为：用伪结核棒状杆菌菌体作为包被抗原，确定抗原包被浓度，待检血清稀释度，并界定阴阳血清的临界值，建立并组装间接ELISA检测试剂盒。包被抗原的制备：将伪结核棒状杆菌单菌落接种于5mLLB培养液中，在200～220rpm，37℃的条件下扩大培养48h后，10000～12000rpm离心3～5min，收集菌体，用PBS洗涤菌体三次，用碳酸盐缓冲液重悬菌体，制成菌悬液，此即为包被抗原。配制不同浓度的包被抗原，确定包被抗原浓度对应的OD600值在0.060～0.090之间。界定了待检血清的临界值。与现有技术相比，本专利技术具有的优点和效果如下：本专利技术以完整的伪结核棒状杆菌菌体作为包被抗原，建立间接ELISA检测方法，检测病羊血清中是否含有抗伪结核棒状杆菌的抗体，依此判断病羊是否感染伪结核，该诊断方法能够针对性的检测抗羊伪结核抗体，为伪结核防控提供有力监测手段。四、具体实施方式：本专利技术涉及的羊伪结核抗体检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：1．间接ELISA检测方法的建立步骤一、包被抗原的制备将伪结核棒状杆菌单菌落接种于5mLLB培养液中，在200～220rpm，37℃的条件下扩大培养48h后，10000～12000rpm离心3～5min，收集菌体。用PBS洗涤菌体三次，用碳酸盐缓冲液重悬菌体，制成菌悬液。此即为包被抗原。步骤二、酶标板的包被在分光光度计上调整伪结核棒状杆菌菌悬液的浓度使其OD600在0.060～0.090范围，取菌悬液100μL/孔加至酶标板，置于4℃过夜。包被结束后，将PBST添加至酶标板，200μL/孔，轻微震荡10s后，弃掉酶标板中的PBST，重复洗涤3次，最后一次洗涤结束后于干净纱布拍干孔中残留PBST。步骤三、封闭取5%（百分比）脱脂奶粉，100μL/孔添加至酶标板，37℃封闭1～3h。封闭结束后洗涤，洗涤操作同步骤二。步骤四、一抗血清的孵育将待检血清做1:400（体积比）稀释后，100μL/孔添加至酶标板中，37℃孵育1h。孵育结束后，洗涤操作同步骤二。步骤五、酶标二抗的孵育用PBST对酶标二抗做1∶5000稀释，100μL/孔添加至酶标板中，37℃孵育1h。孵育结束后，洗涤操作同步骤二。步骤六、显色取4℃避光保存的TMB显色液，100μL/孔添加至酶标板，37℃孵育20min。步骤七、反应终止及结果测定取室温保存的2M稀H2SO4，100μL/孔添加至酶标板，于酶标仪450nm读取结果。2．包被抗原浓度的确定将纯化培养的伪结核棒状杆菌的菌体作为包被抗原，CLA的阳性血清为阳性对照，在酶标板上进行方阵滴定试验。用碳酸盐缓冲液将伪结核棒状杆菌菌体重悬，在酶标仪上调整其浓度，使其OD600分别为0.1、0.08、0.05、0.03、0.01，100μL/孔纵向包被酶标板，各浓度分别包被一列，置于4℃，包被过夜。按照上述间接ELISA检测方法操作，以P/N值最大确定抗原的最佳包被浓度，根据试验结果得，当OD600为0.08时所对应的菌液浓度为抗原的最佳包被浓度。具体检测结果如表1：表1·抗原包被浓度检测结果3．临界值的确定按照1中ELISA操作步骤，将20份标准阴性血清做1∶400稀释后作为一抗血清，测定其OD450，计算器平均值（）和标准差（SD），临界值即为OD450和3SD之和，本研究所确定的临界值为0.329。具体测定结果如表2：4．特异性试验按照1中ELISA操作步骤，分别将羊口疮阳性血清、羊痘阳性血清、乳房炎阳性血清做1:400稀释，测定其OD450，同时设置伪结核标准阳性血清、阴性血清做阳性、阴性对照，检测结果显示羊口疮阳性血清、羊痘阳性血清、乳房炎阳性血清的测定结果均小于阳性临界值0.329，说明本研究所确定的试验方法特异性良好。具体试验结果如表3：5．重复性试验（1）批内重复性试验：在同一块酶标板上，取伪结核标准阳性血清、阴性血清各5份，按照1中ELISA操作步骤，测定OD450，每份血清做三个重复，计算批内变异系数（CV），批内CV=（SD/OD450平均值）×100%。结果显示，批内变异系数均小于5%。具体试验结果如表4：（2）批间重复性试验：在不同批次包被的酶标板上，取伪结核标准阳性血清、阴性血清各5份，按照1中ELISA操作步骤，测定OD450，每份血清做三个重复，计算批间变异系数（CV），批间CV=（SD/OD450）×100%。结果显示，批间变异系数均小于10%。具体试验结果如表5：6．ELISA试剂盒的组装伪结核间接ELISA检测试剂盒具体组成如下：（1）空白96孔酶标板一块；（2）伪结核棒状杆菌纯品一支，置于-20℃保存，使用前，用包被稀释液调整OD600值至0.08；（3）CLA阳性血清，CLA阴性血清各一支；（4）辣根过氧化物酶标记的兔抗羊抗体，使用前，用样品稀释液1:5000稀释；（5）TMB本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种山羊伪结核杆菌抗体的ELISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述的制备方法为：用伪结核棒状杆菌菌体作为包被抗原，确定抗原包被浓度，待检血清稀释度，并界定阴阳血清的临界值，建立并组装间接ELISA检测试剂盒。

【技术特征摘要】
1.一种山羊伪结核杆菌抗体的ELISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述的制备方法为：用伪结核棒状杆菌菌体作为包被抗原，确定抗原包被浓度，待检血清稀释度，并界定阴阳血清的临界值，建立并组装间接ELISA检测试剂盒；包被抗原的制备：将伪结核棒状杆菌单菌落接种于5mLLB培养液...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈德坤，霍宁宁，刘鹤媛，周铭，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61