本发明专利技术提供炭疽、布病、结核三重PCR检测的引物对，为序列表中SEQ ID No.4‑9。本发明专利技术还提供炭疽、布病、结核三重PCR检测的试剂盒。本发明专利技术建立了快速、准确、特异性强、灵敏度高、重复性好的多重PCR诊断技术，可以通过一种检测方法一次性检测出三种危害较大的人兽共患病，不仅能够大量节省人力物力，同时为动物及动物产品的流行病学调查及疫情监测提供了技术支撑。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物疫病检测
，具体涉及炭疽、布病、结核三重PCR检测的引物对及试剂盒。
技术介绍
布鲁氏菌病(BruceUosis．简称布病)又称地中海弛张热，马耳他热，波浪热或波状热。是由布鲁氏菌 (Brucella，简称布氏菌)侵入机体，引起传染变态反应的人畜共患传染病。布鲁氏菌感染后主要造成动物生殖系统的损害：在雌性动物中，导致流产，繁殖生育能力下降：在雄性动物中，导致睾丸炎和附睾炎．并常常发展为不育症。布鲁氏菌为兼性细胞内寄生菌，持续性感染是常见的。病原体通过生殖系统和乳腺分泌液排出体外。人是终末宿主。常表现为持续性感染，间歇性流感样症状，称为“波浪热”。临床特点为长期发热、多汗、关节痛及肝脾肿大等。我国对布病的研究起步比较晚，20世纪50年代中期才开始对布病进行有计划有组织地调查研究。我国科技工作者经过几十年的努力，查清了布病在国内的分布，并且认识到布病在我国的严峻形势。目前布病检测主要分为病原分离培养和血清学实验。细菌学操作复杂，首先要收集病料，制备特定及选择性培养基，然后进行接种培养，3d后才能鉴定结果，由于细菌学操作所需时间长，检测结果误差大。布鲁氏菌病的血清学诊断方法种类较多，现在我国常用虎红平板凝集试验(RBPT)、试管凝集试验(SAT)和补体结合试验(CFI)等血清学方法，但这些血清学方法有的特异性和灵敏性不高，有的操作繁琐。RBPT方法主要用于初筛，由于其特异性不高，受试验温度和凝集时间相对较短的影响，不易准确判定结果，故对RBPT阳性者，还必须经SAT或CFI检测为阳性才能最终判定为阳性。SAT是我国布氏杆菌病诊断的法定方法，但是该法操作繁杂、费时，不适于现场采用。CFF由于条件要求高，基层兽医站难以采用。结核分枝杆菌主要分为人型、 牛型、 禽型和非洲型，牛型分枝杆菌可以感染人，结核病牛是人类结核病的重要传染源。牛结核病是由抗酸、生长缓慢、非光产色的牛结核分枝杆菌引起的动物和人的一种慢性细菌性疾病。该病呈世界性分布，在很多国家仍然是牛和其它家畜以及某些野生动物的主要传染病，而且能够传播给人类，给人类带来健康问题。该病常常通过空气传播，也可以通过摄食污染的饲料、饮水等而经消化道感染后，形成结节状肉芽肿称为结核。特征性结核病变最常见于肺、咽喉、支气管、纵隔淋巴结，病变也常见于肠系膜淋巴结、肝、脾、浆膜及其它器官。在家畜中，牛最易感染结核病，特别是奶牛，其次是水牛和黄牛。世界动物卫生组织(OIE)将牛结核病列为B类动物疫病。我国目前常用的诊断方法是结核菌素皮内变态反应（PPD）。该方法存在着极强的非特异性，PPD的质量和剂量、结果判定标准及操作方法等因素均能影响检测结果，这些不同因素均给基层的净化工作带来困难，而且在实际工作中，用于诊断牛结核病并不十分理想。炭疽( anthrax ) 是由炭疽杆菌( bacil lus anthracis ) 所致的一种人畜共患传染病。兽类炭疽以急性、热性、败血性为主要发病特点, 以天然孔出血、血液呈煤焦油样凝固不良、皮下及浆膜下结缔组织出血性浸润、脾脏显著肿大为主要病变特征；而人炭疽则以皮肤疹疱、溃疡、坏死、焦痂和周围组织广泛水肿为主要临床表现特点。炭疽的诊断分为细菌学检测和血清学检测，细菌学检测包括直接染色镜检和细菌分离，细菌学检测操作复杂，费时费力存在一定的生物安全风险。血清学检测有AsCOli 氏反应，用加热抽提待检炭疽菌体多糖抗原与已知抗体进行的沉淀试验，适用各种病料，方法简便，应用较广，但该反应的特异性不高，敏感性也较差。酶联免疫吸附试验(ELISA) 主要用于检验被检血清中的特异性抗毒素抗体。此法具有高度的特异性，快速，可重复性强；缺点是试验中需用相当多量的提纯抗原f一次试验约45 mg ，而且目前尚无商品诊断盒，因而只限在一些专门的实验室进行。PCR(多聚酶联反应)技术是一项体外酶促扩增DNA新技术，具有特异性和敏感性高，操作简便，快速高效等特点，已广泛用于畜禽传染病和遗传病诊断，生物工程等方面。PCR技术已用于各种疫病的诊断及各种菌属和种的PCR特异性鉴定，它的发展方便了不宜培养且生长缓慢的细菌研究。用PCR技术可以特异地检测到很少量的病原菌，结果表明PCR的应用能够更准确的鉴别感染动物且可能取代常规检查法。多重PCR是一种特殊PCR 形式,是在传统PCR原理的基础上进行改进，即在同一体系中加入多对特异性引物，对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增出多个目的DNA片段。可快速检测鉴别多种病原体,在临床多种病原体混合感染的鉴别诊断上具有独特优势和很高的实用价值,同时该方法快速、准确、特异性强、灵敏度高、重复性好。
技术实现思路
本专利技术提供了炭疽、布病、结核三重PCR检测的引物对及试剂盒。本专利技术建立了快速、准确、特异性强、灵敏度高、重复性好的多重PCR诊断技术，可以通过一种检测方法一次性检测出三种危害较大的人兽共患病，不仅能够大量节省人力物力，同时为动物及动物产品的流行病学调查及疫情监测提供了技术支撑。本专利技术提供炭疽、布病、结核三重PCR检测的引物对，所述引物对包括：（1）结核杆菌上游引物：5>TGGTAGAGGCGGCGATGGTTGA<3，下游引物：5>AGCCGAGACGATCAACGGCCTA<3；（2）布病上游引物：5>TTACAAGGAAGCGGGCGTGCTG<3，下游引物:5>CTCCACTTTGCCGGTCGTGCAT<3；（3）炭疽上游引物：5>TAGAAAGGCGGATAGCGGCGGT<3，下游引物: 5>TGACTCATCCGCCCCAACTGCT<3。（4）与（1）-（3）中任一引物互补的核苷酸序列。本专利技术还提供炭疽、布病、结核三重PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述引物对。作为优选，在50μl反应体系中，所述引物对为6μl，每条引物各为1μl。作为优选，所述试剂盒包括DNA模板，所述DNA模板为使用提取试剂对鼻拭子进行DNA提取后的提取产物。作为优选，所述试剂盒的PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火20s，72℃延伸40s，总共32次循环；72℃延伸7min。本专利技术还提供上述引物对在制备炭疽、布病、结核三重PCR检测试剂盒中的应用。本专利技术在采样时只用采集鼻腔棉拭子，相比于传统的采集发病动物血清和组织样本有较低的生物安全风险，能够较好的避免兽医工作人员感染上述人兽共患病。在检测时生物安全风险也较低，可以在生物安全2级实验室内完成，而相对的病原微生物的分离鉴定则需要在生物安全3级实验室内完成。本专利技术建立了快速、准确、特异性强、灵敏度高、重复性好的多重PCR诊断技术，可以通过一种检测方法一次性检测出三种危害较大的人兽共患病，不仅能够大量节省人力物力，同时为动物及动物产品的流行病学调查及疫情监测提供了技术支撑。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1为不同病原菌提取的DNA用本专利技术的引物进行PCR扩增后，反应产物电泳结果；图2为本专利技术的引物的敏感性试验结果；图3为本专利技术的引物的特异性试验本文档来自技高网...
【技术保护点】
炭疽、布病、结核三重PCR检测的引物对，其特征在于：所述引物对包括：（1）结核杆菌上游引物：5>TGGTAGAGGCGGCGATGGTTGA<3，下游引物：5>AGCCGAGACGATCAACGGCCTA<3；（2）布病上游引物：5>TTACAAGGAAGCGGGCGTGCTG<3，下游引物:5>CTCCACTTTGCCGGTCGTGCAT<3；（3）炭疽上游引物：5>TAGAAAGGCGGATAGCGGCGGT<3，下游引物: 5>TGACTCATCCGCCCCAACTGCT<3；（4）与（1）‑（3）中任一引物互补的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.炭疽、布病、结核三重PCR检测的引物对，其特征在于：所述引物对包括：（1）结核杆菌上游引物：5>TGGTAGAGGCGGCGATGGTTGA<3，下游引物：5>AGCCGAGACGATCAACGGCCTA<3；（2）布病上游引物：5>TTACAAGGAAGCGGGCGTGCTG<3，下游引物:5>CTCCACTTTGCCGGTCGTGCAT<3；（3）炭疽上游引物：5>TAGAAAGGCGGATAGCGGCGGT<3，下游引物: 5>TGACTCATCCGCCCCAACTGCT<3；（4）与（1）-（3）中任一引物互补的核...
【专利技术属性】
技术研发人员：贺奋义，周峰，豆玲，郭慧琳，贺泂杰，豆思远，张登基，
申请(专利权)人：甘肃省动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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