一种猪瘟病毒抗体竞争化学发光定量检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种猪瘟病毒抗体竞争化学发光定量检测试剂盒，该试剂盒包括包被抗原包被板、酶标抗体、校准品、浓缩洗涤液、发光底物A、发光底物B；所述抗原包被板，将纯化的猪瘟病毒E2蛋白作为包被抗原；酶标抗体为酶标抗体由辣根过氧化物酶标记的猪瘟病毒单克隆抗体；所述校准品，将活疫苗免疫的高免血清采用校准品稀释液分别稀释到浓度为0 NU/mL、2NU/mL、5 NU/mL、10 NU/mL、30 NU/mL和60NU/mL；所述发光底物A中含有鲁米诺，羟基香豆素、没食子酸和Tris‑Hcl缓冲液；本发明专利技术试剂盒具有检测时间短，检测信号大大增强，灵敏度高等优点。

A competitive chemiluminescence quantitative detection kit for swine fever virus

The present invention relates to a light-emitting quantitative detection kit a swine fever virus antibody competitive chemical, the kit includes antigen coated plate, enzyme labeled antibody, calibrator, concentrated washing liquid, substrate A, substrate B; the antigen coated plate, the purified E2 protein of classical swine fever virus as coating antigen; enzyme antibody as enzyme labeled antibody by CSFV monoclonal antibody labeled with horseradish peroxidase; the calibrator, the inactivated vaccine of hyperimmune serum using calibrated diluent were diluted to a concentration of 0 NU/mL, 5 2NU/mL, NU/mL, 10 NU/mL, 30 NU/mL and by 60NU/mL; the substrate A contains Lumino, hydroxycoumarin, gallic acid and Tris Hcl buffer; the kit of the invention has short detection time, detection signal is greatly enhanced, the advantages of high sensitivity.

【技术实现步骤摘要】
一种猪瘟病毒抗体竞争化学发光定量检测试剂盒
本专利技术涉及一种试剂盒，具体的说是一种猪瘟病毒抗体竞争化学发光定量检测试剂盒。
技术介绍
猪瘟又名霍乱，我国俗称俗称“烂肠瘟”，是由猪瘟病毒引起猪的一种高度接触性传染病，会出现小血管壁变性、内脏器官多发性出血、坏死和梗死。该病传播快、流行广、发病率高和死亡率高，危害极大。世界卫生组织将其列为法定的报告动物疫病，我国2008年修订的《一、二、三类动物疫病病种记录》将其列为一类动物疫病。我国猪瘟特征是以非典型猪瘟或温和型猪瘟以及妊娠母猪繁殖障碍为主要表现形式，持续感染、隐性感染、混合感染和免疫失败现象普遍存在。目前我国的防治措施中以疫苗免疫为主，对疫苗免疫效果的评价主要通过猪瘟抗体水平的检测。因此猪瘟病毒抗体快速检测成为了控制和消灭该病的前提。目前的猪瘟诊断技术,主要有补体结合试验、琼脂免疫扩散试验、病毒中和试验等方法。但是,传统的检测方法都需要较长时间的诊断过程,以及一定的实验技能和仪器设备,一般只适用实验室的诊断。近年来，ELISA诊断技术取得了很大的进步，有许多敏感性高、特异性好的ELISA方法已经运用到疫苗免疫群体的大规模血清学检验当中，这些方法主要是间接ELISA和阻断ELISA。这些方法虽然灵敏度高、特异性强，但存在内源性酶干扰、底物大部分有毒或为致癌物质等缺点。开发一种安全、灵敏、高效的检测诊断方法十分必要。化学发光免疫分析(ChemiluminescenceImmunoassay,CLIA)是近十年来在世界范围内发展非常迅速的非放射性免疫分析，是继放射免疫分析和酶免疫分析之后发展起来的一种超高灵敏度的微量测定技术。化学发光免疫分析将抗原与杭体的高特异性免疫反应与高灵敏的化学发光检测技术相结合，将化学发光物质标记杭原或杭体，再进行免疫结合反应，即可进行定性、定量测定。该方法具有高灵敏度、检测范围宽、操作简便快速、标记物稳定、无污染、仪器简单经济等优点。如果将两种方法有效的结合在一起，就可以使口蹄疫的检测更快速、更灵敏、更准确、更安全。
技术实现思路
本专利技术目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种猪瘟病毒抗体竞争化学发光定量检测试剂盒，其具有检测时间短，检测信号大大增强，灵敏度高等优点，且实现了猪瘟病毒抗体定量检测。本专利技术为解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种猪瘟病毒抗体竞争化学发光定量检测试剂盒，包括抗原包被板、酶标抗体、校准品、浓缩洗涤液、发光底物A、发光底物B；所述抗原包被板，将纯化的猪瘟病毒E2蛋白作为包被抗原，使用PH9.6的碳酸盐缓冲液将猪瘟病毒E2蛋白包被在不透明聚苯乙烯板上；所述酶标抗体为酶标抗体由辣根过氧化物酶标记的猪瘟病毒单克隆抗体；采用戊二醛方法进行标记，即将猪瘟病毒单克隆抗体、戊二醛和辣根过氧化物酶加入容器中进行交联，所得混合物，进行透析除去过量的戊二醛；在透析后的混合物中，加入等体积的甘油，置于-20℃保存；所述校准品，将活疫苗免疫的高免血清采用校准品稀释液分别稀释到浓度为0NU/mL、2NU/mL、5NU/mL、10NU/mL、30NU/mL和60NU/mL；所述剂量单位NU/mL的建立方法为，根据血清的细胞中和试验结果，挑选效价分别为全阴血清、1:2、1:20、1:80、1:960、1:2560的血清，建立起和中和试验血清效价相对应的线性关系，并且建立起和中和试验血清效价分别为全阴血清、1:2、1:20、1:80、1:960、1:2560相对应的校准品，校准品分别为0、2、5、10、30、60，并且建立剂量单位NU/ml；所述浓缩洗涤液，为含有0.05%的Tween-20的PBS缓冲液，使用时采用蒸馏水进行稀释；所述发光底物A中含有鲁米诺0.15mmol/L，羟基香豆素0.59mmol/L、没食子酸0.35mmol/L和Tris-Hcl缓冲液0.2mol/L，余量为水；所述发光底物B中含有氨基酸氧化酶0.85mmol/L，吐温-20体积浓度为.8%，DTPA0.5mmol/L、维生素C0.12mmol/L和乙酸-乙酸盐缓冲液0.2mol/L，余量为水；所述校准品稀释液为每1000mLPBS缓冲液中加入10g牛血清白蛋白，再加入质量浓度为0.5‰的NaN3（三氮化钠）。所述猪瘟病毒抗体竞争化学发光定量检测试剂盒检测猪瘟病毒抗体的方法，包括以下步骤：（1）加样取出抗原包被板，每块板可检测样本90份，设校准品6孔；样本孔每孔加入50µl的样本，校准品孔每孔各加入50µl，再向以上各孔中立即加入50µl酶结合物；（2）孵育置37℃恒温培养箱内孵育30±1分钟；（3）洗板采用蒸馏水进行对浓缩洗涤液进行稀释得到洗涤液；将各孔的液体弃入废液筒，每孔加入洗涤液28±20µl，浸泡约30秒，弃去洗涤液，连续洗涤5次；在最后一次洗涤液弃去后，将孔中残留的洗涤液在吸水纸上拍干；（4）加入发光底物、测定每孔加入50µl发光底物A和50µl发光底物B，18～26℃避光5min后在发光仪上测定；（5）结果判定以校准品发光值为纵坐标，对应的校准品浓度为横坐标，绘制校准品的四参数标准曲线，四参数模式为Y=(a-d)/[1+(x/c)b]+d；（其中a--吸光度上限值，b-吸光度增长速率参数，相当于曲线的斜率；c--吸光度增长速度开始发生变化的浓度值，相当于半数反应浓度（EC50）；d--吸光度下限值；y-发光值，x-最终得到的实际含量；）将样本的发光值代入标准曲线中，从校准曲线上直接读出样品中猪瘟病毒抗体的含量，剂量值≥2.5NU/mL，判定为阳性；剂量值＜2.5NU/mL，判定为阴性。所述步骤（4）中每孔加入50µl发光底物A和50µl发光底物B可替换为，发光底物A和发光底物B等体积比混匀后，添加洗涤液补充至100µl。有益效果是：1、本专利技术试剂盒，可检测0～2000万的发光值，线性范围大，30min可检出结果；传统酶免分析法，可检测0～3.5的OD值，线性范围小，75min可检出结果；化学发光实现了检测时间短，检测信号大大增强；敏感性检验结果显示其具有检测更为准确灵敏。2、根据血清中和试验的不同血清效价如全阴血清、1:2、1:20、1:80、1:960、和1:2560等建立起相应的校准品浓度及单位，建立起和中和试验血清效价相对应的线性关系，并且建立新的剂量单位NU/mL，在大分子上首先实现了猪瘟病毒抗体定量检测，并可以快速的定量检测大批样本，快速准确，具有技术上的显著进步。酶标单抗隆抗体的制备，实现了一步法30min出结果，血清不需要稀释直接加样，缩短了反应时间，简化了操作过程。采用发光底物，相较传统的显色底物，加入发光底物后无需终止可以直接读值，缩短了操作时间，致癌性和危害性较小，更为安全无污染。具体实施方式一种猪瘟病毒抗体竞争化学发光定量检测试剂盒，包括抗原包被板、酶标抗体、校准品、浓缩洗涤液、发光底物A、发光底物B；所述抗原包被板，将纯化的猪瘟病毒E2蛋白作为包被抗原，使用PH9.6的碳酸盐缓冲液将猪瘟病毒E2蛋白包被在不透明聚苯乙烯板上；所述酶标抗体为酶标抗体由辣根过氧化物酶标记的猪瘟病毒单克隆抗体；采用戊二醛方法进行标记，即将猪瘟病毒单克隆抗体、戊二醛和辣根过氧化物酶加入容器中进行交联，所得混合物，进行透析除去过量的戊二醛；在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪瘟病毒抗体竞争化学发光定量检测试剂盒，包括抗原包被板、酶标抗体、校准品、浓缩洗涤液、发光底物A和发光底物B，其特征在于：所述抗原包被板，将纯化的猪瘟病毒E2蛋白作为包被抗原，使用PH9.6的碳酸盐缓冲液将猪瘟病毒E2蛋白包被在不透明聚苯乙烯板上；所述酶标抗体为酶标抗体由辣根过氧化物酶标记的猪瘟病毒单克隆抗体；采用戊二醛方法进行标记，即将猪瘟病毒单克隆抗体、戊二醛和辣根过氧化物酶加入容器中进行交联，所得混合物，进行透析除去过量的戊二醛；在透析后的混合物中，加入等体积的甘油，置于‑20℃保存；所述校准品，将活疫苗免疫的高免血清采用校准品稀释液分别稀释到浓度为0 NU/mL、2NU/mL、5 NU/mL、10 NU/mL、30 NU/mL和60NU/mL；所述剂量单位NU/mL的建立方法为，根据血清的细胞中和试验结果，挑选效价分别为全阴血清、1:2、1:20、1:80、1:960、1:2560的血清，建立起和中和试验血清效价相对应的线性关系，并且建立起和中和试验血清效价分别为全阴血清、1:2、1:20、1:80、1:960、1:2560相对应的校准品，校准品分别为0、2、5、10、30、60，并且建立剂量单位NU/ml；所述浓缩洗涤液，为含有0.05%的Tween‑20的PBS缓冲液，使用时采用蒸馏水进行稀释；所述发光底物A中含有鲁米诺0.15mmol/L，羟基香豆素0.59mmol/L、没食子酸0.35mmol/L和Tris‑Hcl缓冲液0.2mol/L，余量为水；所述发光底物B中含有氨基酸氧化酶0.85mmol/L，吐温‑20 体积浓度为.8%， DTPA 0.5mmol/L、维生素C 0.12mmol/L和乙酸‑乙酸盐缓冲液0.2mol/L，余量为水。...

【技术特征摘要】
1.一种猪瘟病毒抗体竞争化学发光定量检测试剂盒，包括抗原包被板、酶标抗体、校准品、浓缩洗涤液、发光底物A和发光底物B，其特征在于：所述抗原包被板，将纯化的猪瘟病毒E2蛋白作为包被抗原，使用PH9.6的碳酸盐缓冲液将猪瘟病毒E2蛋白包被在不透明聚苯乙烯板上；所述酶标抗体为酶标抗体由辣根过氧化物酶标记的猪瘟病毒单克隆抗体；采用戊二醛方法进行标记，即将猪瘟病毒单克隆抗体、戊二醛和辣根过氧化物酶加入容器中进行交联，所得混合物，进行透析除去过量的戊二醛；在透析后的混合物中，加入等体积的甘油，置于-20℃保存；所述校准品，将活疫苗免疫的高免血清采用校准品稀释液分别稀释到浓度为0NU/mL、2NU/mL、5NU/mL、10NU/mL、30NU/mL和60NU/mL；所述剂量单位NU/mL的建立方法为，根据血清的细胞中和试验结果，挑选效价分别为全阴血清、1:2、1:20、1:80、1:960、1:2560的血清，建立起和中和试验血清效价相对应的线性关系，并且建立起和中和试验血清效价分别为全阴血清、1:2、1:20、1:80、1:960、1:2560相对应的校准品，校准品分别为0、2、5、10、30、60，并且建立剂量单位NU/ml；所述浓缩洗涤液，为含有0.05%的Tween-20的PBS缓冲液，使用时采用蒸馏水进行稀释；所述发光底物A中含有鲁米诺0.15mmol/L，羟基香豆素0.59mmol/L、没食子酸0.35mmol/L和Tris-Hcl缓冲液0.2mol/L，余量为水；所述发光底物B中含有氨基酸氧化酶0.85mmol/L，吐温-20体积浓度为.8%，DTPA0.5mmol/L、维生素C0.1...

【专利技术属性】
技术研发人员：李秀梅，王琴，刘玉宝，徐璐，耿玉静，任雪建，李莹，
申请(专利权)人：洛阳莱普生信息科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41