本发明专利技术涉及一种乙型肝炎病毒e抗原的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法和检测方法，试剂盒包括含有荧光素标记的乙型肝炎病毒e抗原抗体的溶液、包被有荧光素抗体的磁微粒的悬浮液，以及含有碱性磷酸酶标记的乙型肝炎病毒e抗原抗体的溶液。本发明专利技术使得能够以更低成本和更高准确度和精密度对乙型肝炎病毒e抗原进行定量检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种结合了免疫磁微粒分离技术和化学发光免疫分析技术的乙型肝炎病毒e抗原的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法和检测方法。
技术介绍
乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)是以隐蔽形式存在HBV核心中的一种可溶性蛋白，其编码基因相互重叠，是HBcAg的亚成分。在感染HBV后，HBeAg可与HBsAg同时或稍后出现于血中，其消失则稍早于HBsAg。HBsAg仅存在于HBsAg阳性者的血液中，通常伴有肝内HBV DNA的复制，血中存在较多Dane颗粒和HBV DNA聚合酶活性增高，因此，HBeAg阳性是病毒活动性复制的重要指标，传染性高。急性肝炎患者若HBeAg持续阳性10周以上，则易于转为持续感染。目前用于检测乙型肝炎病毒e抗原的免疫分析方法主要有酶联免疫分析法、化学发光免疫分析法等。酶联免疫分析法存在灵敏度低，线性范围窄、不易实现全自动化等方法学限制因素。化学发光免疫分析法是在酶联免疫分析法基础上发展起来的一种免疫检测技术，具有灵敏度高、检测线性范围宽、操作简便，自动化程度高等优势。目前化学发光免疫分析技术因其具有上述诸多优点得到了广泛的应用。然而，在实际的免疫检测中，由于待测样品中所含的杂质成分较多，一定程度上影响了检测灵敏度和准确性，所以从复杂的样品基质中快速分离、纯化出目的待测物，是临床检验工作者面临的难题之一。磁微粒免疫检测技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作载体，以物理吸附、化学偶联等方法包被上具有特异性亲和力的抗体或抗原等各种免疫活性物质，具有分离速度快、效率高、可重复性好、操作简单、不影响被分离细胞或其他生物材料的生物学性状和功能等特点，在外加磁场作用下可定向运动，使得某些特殊成分得以分离、浓集或纯化。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种乙型肝炎病毒e抗原的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其能够以较低的成本制备得到，且能够实现乙型肝炎病毒e抗原准确和高精确地定量测定。本专利技术同时还提供一种乙型肝炎病毒e抗原的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒的制备方法，该方法工艺稳定，成本低，且所得试剂盒的精密度高。癌抗原所用的试剂盒的简便和低成本的制备方法。一种乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括第一试剂含荧光素标记的乙型肝炎病毒e抗原抗体的溶液；第二试剂含碱性磷酸酶(ALP)标记的乙型肝炎病毒e抗原抗体的溶液；磁分离剂含包被着荧光素抗体的磁微粒的悬浮液。优选地，该碱性磷酸酶标记的乙型肝炎病毒e抗原抗体由碱性磷酸酶与乙型肝炎病毒e抗原抗体通过交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(Succinimidyl 4-(N-Maleimidomethyl) Cyclohexane-l-Carbo, SMCC)和 2_ 亚氨基硫烧盐酸盐(2-1minothiolane HCl, 2-1T)连接构成。进一步地，所述磁微粒试剂中，包被有荧光素抗体的磁微粒由荧光素抗体与磁微粒通过偶联剂相化学偶联。进一步地，所述第一试剂中的荧光素标记的乙型肝炎病毒e抗原抗体的浓度为O. 5^1 μ g/mL，所述第一试剂的pH为7-9 ;所述第二试剂中的碱性磷酸酶标记的乙型肝炎病毒e抗原抗体的浓度为O. 5! μ g/mL,所述第二试剂的pH为7_9。本领域技术人员应知晓，本专利技术的试剂盒还可以进一步包括有其它检测所需的试齐U，例如底物溶液。但是诸如底物溶液等其它试剂可以另行购买或配制，因此，虽然试剂盒中可以包括这些试剂，但它们对于本专利技术试剂盒来说并非必不可少。本专利技术采取的又一技术方案是一种上述的乙型肝炎病毒e抗原的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒的制备方法，其包括分别制备所述第一试剂、所述第二试剂以及磁分离剂的步骤，其中所述第二试剂的制备过程如下①将乙型肝炎病毒e抗原抗体加入交联剂2-亚氨基硫烷盐酸盐溶液中室温静置后，再加入甘氨酸溶液，再次室温静置，收集活化后的乙型肝炎病毒e抗原抗体，于疒8°C下保存备用； ②将碱性磷酸酶溶液加入交联剂4- (N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液，室温静置，收集活化后的碱性磷酸酶，于疒8°C下保存备用；③将上述步骤①所得活化后的乙型肝炎病毒e抗原抗体与步骤②所得活化后的碱性磷酸酶混合，静置反应，使生成碱性磷酸酶标记的乙型肝炎病毒e抗原抗体，反应结束后，将反应液用Supperdex200凝胶纯化柱纯化，选择具有适当pH值的缓冲液调整浓度和pH值即得所述第二试剂；其中，所述的乙型肝炎病毒e抗原抗体、所述碱性磷酸酶的纯度均大于等于95wt%,且所述碱性磷酸酶的比活性超过1000u/mg。优选地，步骤①中，取乙型肝炎病毒e抗原抗体，加入交联剂2-1T溶液溶解，室温静置10mirT30min，加入甘氨酸溶液，室温静置2 lOmin，用G-25凝胶纯化柱除盐，收集活化后的乙型肝炎病毒e抗原抗体，于2-8°C保存备用。优选地，步骤②中，取浓度大于等于5mg/mL的碱性磷酸酶溶液，加入交联剂SMCC溶液，室温静置2(T40min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后碱性磷酸酶，于2_8°C保存备用。优选地，步骤③中，将上述活化的乙型肝炎病毒e抗原抗体与活化的碱性磷酸酶按分子摩尔比为I I 2混合，于2-8°C条件下静置12-24h。其中适当pH值的缓冲液可以为例如含有O. 5%牛血清白蛋白、pH8. O的TRIS缓冲液。进一步地，所述的第一试剂的制备方法如下配制含有荧光素的pH为扩10的缓冲液，然后按照荧光素与乙型肝炎病毒e抗原抗体的分子比为2(Γ200:1的比例，将所述含有荧光素的PH为扩10的缓冲液与乙型肝炎病毒e抗原抗体的pH为扩10的缓冲液混合，混匀后，室温静置反应，然后将反应液通过G-25凝胶柱进行分离，除去游离的荧光素，得到含有荧光素标记的抗乙型肝炎病毒e抗原抗体的溶液，接着用具有适当pH值的缓冲液调整浓度和pH，即得所述的第一试剂。其中适当pH值的缓冲液可以为例如含有O. 5%牛血清白蛋白、pH8. O的TRIS缓冲液。进一步地，所述磁分离剂的制备方法如下将含有羧基活性基团的磁微粒与荧光素抗体在偶联剂碳二亚胺的存在下，室温反应2 18小时，反应结束，磁分离，去上清，用具有适当PH值的缓冲液调整pH和浓度，即得所述的磁分离剂。其中所述的磁微粒具有超顺磁性，其直径为O. 5^2 μ m,每克磁微粒上所带的羧基活性基团的含量不低于O. 4mmol ;所述的荧光素抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，纯度大于等于90wt%，稀释效价大于1:100万。优选地，上述的具有适当pH值的缓冲液为含有O. 5%牛血清白蛋白、pH8. O的TRIS缓冲液。本专利技术所述的荧光素可以是已知的各种荧光素，常用的有例如异硫氰酸荧光素，四乙基罗丹明，四甲基异硫氰酸罗丹明等。本专利技术同时还提供了一种采用上述的试剂盒应用于乙型肝炎病毒e抗原定量检测的检测方法，其特征在于，包括以下步骤(I)免疫反应在检测管中加入待测样本原液，依次加入第一试剂和第二试剂，混匀，在25 40°C下进行第一次温育，然后加入磁分离试剂，混匀，在25 40°C下进行第二次 温育；(2)洗涤使磁微粒在磁场中沉降，去本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种乙型肝炎病毒e抗原的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，所述试剂盒包括：第一试剂：含荧光素标记的乙型肝炎病毒e抗原抗体的溶液；第二试剂：含碱性磷酸酶标记的乙型肝炎病毒e抗原抗体的溶液；磁分离剂：含包被着荧光素抗体的磁微粒的悬浮液。
【技术特征摘要】
1.一种乙型肝炎病毒e抗原的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，所述试剂盒包括第一试剂含荧光素标记的乙型肝炎病毒e抗原抗体的溶液；第二试剂含碱性磷酸酶标记的乙型肝炎病毒e抗原抗体的溶液；磁分离剂含包被着荧光素抗体的磁微粒的悬浮液。2.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒e抗原的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于所述碱性磷酸酶标记的乙型肝炎病毒e抗原抗体由碱性磷酸酶与乙型肝炎病毒e抗原抗体通过交联剂4- (N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和2-亚氨基硫烷盐酸盐连接构成。3.根据权利要求1或2所述的乙型肝炎病毒e抗原的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于所述第一试剂中的荧光素标记的乙型肝炎病毒e抗原抗体的浓度为O.5^1 μ g/mL，所述第一试剂的pH为7-9 ;所述第二试剂中的碱性磷酸酶标记的乙型肝炎病毒e抗原抗体的浓度为O. 5! μ g/mL,所述第二试剂的pH为7_9。4.一种如权利要求3所述的乙型肝炎病毒e抗原的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒的制备方法，其包括分别制备所述含有荧光素标记的乙型肝炎病毒e抗原抗体的溶液、所述含有碱性磷酸酶标记的乙型肝炎病毒e抗原抗体的溶液以及所述包被有荧光素抗体的磁微粒的悬浮液的步骤，其特征在于所述含有碱性磷酸酶标记的乙型肝炎病毒e抗原抗体的溶液的制备过程如下①将乙型肝炎病毒e抗原抗体加入交联剂2-亚氨基硫烷盐酸盐溶液中室温静置后，再加入甘氨酸溶液，再次室温静置，收集活化后的乙型肝炎病毒e抗原抗体，于2l°C下保存备用；②将碱性磷酸酶溶液加入交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液，室温静置，收集活化后的碱性磷酸酶，于疒8°C下保存备用；③将上述步骤①所得活化后的乙型肝炎病毒e抗原抗体与步骤②所得活化后的碱性磷酸酶混合，静置反应，使生成碱性磷酸酶标记的乙型肝炎病毒e抗原抗体，反应结束后，将反应液用Supperdex200凝胶纯化柱纯化,选择具有适当pH值的缓冲液调整浓度和pH值即得所述第二试剂；其中，所述的乙型肝炎病毒e抗原抗体、所述碱性磷酸酶的纯度均大于等于95wt%，且所述碱性磷酸酶的比活性超过lOOOu/mg。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤①中，取乙型肝炎病毒e抗原抗体，加入偶联剂2-1T溶液溶解，室温静置10mirT...
【专利技术属性】
技术研发人员：于大为，程晓蕾，
申请(专利权)人：苏州浩欧博生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。