Ⅲ型前胶原N端肽定量测定试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种磁微粒化学发光法Ⅲ型前胶原N端肽定量测定试剂盒及其制备方法。试剂盒由测PⅢNP磁微粒、测PⅢNP示踪结合物、质控品组成，本发明专利技术还提供了一种该定量测定试剂盒的制备方法，其采用的是微粒子化学发光免疫分析技术，可以借助全自动化学发光法进行检测，减少操作时间，降低人为操作误差，提高检测精密度和准确性，适合于临床肝纤维化早期的辅助诊断。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于免疫诊断
，涉及一种定量测定试剂盒，具体涉及一种用于测定Ⅲ型前胶原N端肽的磁微粒化学发光免疫测定试剂盒，本专利技术还涉及该试剂盒的制备方法，以及使用该试剂盒来测定Ⅲ型前胶原N端肽浓度的方法。
技术介绍
肝纤维化是指由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生，导致肝内弥漫性细胞外基质过度沉淀的病理过程，它不是一个独立的疾病，许多慢性肝脏疾病均可引起肝纤维化，其病因大致可分为感染性(慢性乙型、丙型和丁型病毒性肝炎，血汲虫病等)，先天性代谢缺陷(肝豆状核变性、血色病、α1-抗胰蛋白酶缺乏症等)及化学代谢缺陷(慢性酒精性肝病、慢性药物性肝病)及自身免疫性肝炎、原发性肝汁性肝硬化和原发性硬化性胆管炎等。肝纤维化肝脏遭到各种致病原侵袭时，引起肝脏损害与炎症反应，肝组织免疫系统同时被激活，进行组织修复。肝纤维化是指这种组织修复过程、过度及失控时，肝组织内细胞外基质过度增生与异常沉积所致肝脏结构和肝功能异常改变的一种病理过程。Ⅲ型前胶原N端肽(ProcollagenⅢN-terminal Peptide,PⅢNP)是Ⅲ型前胶原在细胞外形成原胶原前被内切酶切下后进入血循环的氨基端尾肽。完整的Ⅲ型胶原肽主要由肝脏通过窦状隙内皮细胞受体介导的内吞作用被清除，而小片段则主要由肾脏排泄清除，故胶原代谢活跃及肝功能损伤时，血液PⅢNP增高。PⅢNP在肝纤维化病人血液中水平的上升与纤维化的活动程度有伴随关系，因此，PⅢNP被视为肝纤维化生成的血清学指标。传统的PⅢNP检测方法包括酶联免疫法、化学发光法、放射免疫法等。但酶联免疫法和化学发光法检测时间长，主要依靠纯手工加样等系列繁琐操作，效率低，导致实验结果易误差大，而酶促反应不够彻底，且易受外部干扰因素影响，如温度、时间及材料浓度等，因此检测时特异性低、灵敏度差、检测范围窄。放射免疫法的优点是灵敏、特异、简便易行、用样量少等，但试剂的半衰期段费用较高，需要用闪烁计数仪等专门的设备，放射性核素对人体存在着一定潜在的危害性，试验废物处理困难，放射性核素标记有时会改变某些生物物质的生理活性。因此，本领域亟需一种在保证灵敏度高、稳定性好的同时操作更加简便、迅速，能够借助分析仪器实现检测过程全自动化的测定试剂盒。专利200810102020.4公开了一种Ⅲ型前胶原N端肽(PⅢNP)化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法。其包括：1)Ⅲ型前胶原N端肽质控品；2)包被有Ⅲ型前胶原N端肽的单克隆抗体的固相载体；3)Ⅲ型前胶原N端肽的单克隆抗体酶标记物；4)化学发光底物；以及5)浓缩洗涤液。进一步，根据本专利技术制备上述试剂盒的方法包括以下步骤：1)以Ⅲ型前胶原N端肽纯品配制Ⅲ型前胶原N端肽质控品；2)以Ⅲ型前胶原N端肽的单克隆抗体包被载体；3)以酶标记Ⅲ型前胶原N端肽的单克隆抗体；4)配制化学发光底物；5)配制浓缩洗涤液；6)分装上述Ⅲ型前胶原N端肽质控品、酶标记物、化学发光底物和浓缩洗涤液；以及7)组装为成品。该试剂盒具有简便、快速、灵敏、稳定等优点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有高灵敏度和特异性，适合于临床辅助诊断的微粒子化学发光法Ⅲ型前胶原N端肽定量测定试剂盒及其制备方法。本专利技术是在酶免疫分析基础上结合高灵敏度的化学发光测定技术和磁性微粒分离技术，较其他方法有许多独特的优点，首先它用顺磁性微粒作为固相载体，由于颗粒体积小，表面积大，扩大了反应面积，大大提高了灵敏度，其次由于使用全自动仪器及配套试剂，使人为因素减至最低，提高了方法的稳定性和结果的重复性，同时也使得批内差异与批间差异都较小。本专利技术采用的技术方案是：一种Ⅲ型前胶原N端肽定量测定试剂盒，包括测PⅢNP磁微粒、测PⅢNP示踪结合物、质控品，所述测PⅢNP磁微粒为标记有Ⅲ型前胶原N端肽单克隆抗体的磁性微球和磁微粒保存液；测PⅢNP示踪结合物为标记有Ⅲ型前胶原N端肽抗体的示踪标记物和示踪结合物稀释液；质控品为一低含量Ⅲ型前胶原N端肽的溶液和一高含量Ⅲ型前胶原N端肽的溶液，用于测定仪内储存主曲线的校正。本专利技术是利用磁微粒化学发光免疫分析技术定量测定人血浆中Ⅲ型前胶原N端肽的含量。在磁性微粒子上共价标记Ⅲ型前胶原N端肽抗体，加入待测样本，第一步反应形成磁微粒标记抗体-抗原结合物，与第二步反应加入的示踪标记的Ⅲ型前胶原N端肽抗体，形成磁微粒标记抗体-抗原-示踪标记抗体复合物，充分洗涤后，加入激发液，催化发光，相对发光强度(RLU)与人血浆中PⅢNP含量呈正相关，根据标准曲线即可计算出样本中PⅢNP的含量。所述磁性微球为Fe2O3或Fe3O4磁性纳米粒子与有机高分子材料的复合体。所述磁性微球通过表面改性而带有一种或多种活性功能基团，包括但不限于-OH，-COOH，-NH2，-CHO，-SO3H。所述抗体为一种或多种单克隆抗体和/或多克隆抗体。所述示踪标记物为鲁米诺和/或异鲁米诺及其衍生物。所述质控品中Ⅲ型前胶原N端肽浓度为0.1-600ng/mL。所述磁微粒保存液和示踪物稀释液包括稳定剂、表面活性剂、防腐剂，包含但不限于TBS缓冲系统、HAC-NAC缓冲系统、PBS缓冲液系统、MES缓冲系统、HEPES缓冲系统,缓冲能力为调节pH值6.0-8.5，浓度范围为0.01-0.2mol/L。所述稳定剂为新生牛血清(NBS)、牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白(CS)、山梨醇、乙二胺四乙酸(EDTA)中的至少一种；优选所述稳定剂包括0.5-30％NBS和/或BSA。所述表面活性剂为吐温系列、Triton X-100、CTAC中的至少一种；所述吐温系列包括吐温20(TWEEN-20)、吐温21(TWEEN-21)、吐温40(TWEEN-40)、吐温60(TWEEN-60)、吐温61(TWEEN-61)、吐温80(TWEEN-80)、吐温81(TWEEN-81)、吐温85(TWEEN-85)。优选所述表面活性剂为浓度范围为0.1-1％的吐温20。所述防腐剂选自硫柳汞、叠氮钠、抗生素类、proclin中的至少一种；所述硫柳汞的浓度不大于1‰；所述叠氮钠的浓度不大于1‰；所述抗生素类包括庆大霉素等；所述proclin的浓度不大于2‰。稳定剂可以提供良好稳定反应环境，使抗原/抗体保持天然构象，可以选择上述稳定剂其中一种。表面活性剂能够在试剂加入到反应体系时，降低表面张力，提高分散性和稳定性。一种所述Ⅲ型前胶原N端肽定量测定试剂盒的制备方法，具体步骤如下：1)磁微粒标记PⅢNP抗体的制备将带羧基的磁微粒与EDC分别按照1:1、1:2、1:3的重量比例进行混合后，按照每毫克磁微粒分别加入PⅢNP单抗15μg、20μg、25μg、30μg，分别在20℃、23℃、26℃反应1小时，加入甘氨酸，使甘氨酸浓度达到25mM，反应0.5小时，将标记好的磁微粒保存在含1％牛血清白蛋白的0.01M PBS中，于2-8℃贮存；2)异鲁米诺标记PⅢNP抗体的制备将异鲁米诺加入PⅢNP抗体中标记，戊二醛使用浓度分别为0.75％、1.0％、1.25％、1.5％，按照每毫克抗体分别加入异鲁米诺0.05mg、0.10mg、0.15mg、0.20mg，抗体与异鲁米诺的最佳标记比例为10：1，分别在20℃、23℃、26℃反应1.5小时，用PH7.2-7.4的0本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种Ⅲ型前胶原N端肽定量测定试剂盒，包括测PⅢNP磁微粒、测PⅢNP示踪结合物、质控品，其特征在于：所述测PⅢNP磁微粒为标记有Ⅲ型前胶原N端肽单克隆抗体的磁性微球和磁微粒保存液；测PⅢNP示踪结合物为标记有Ⅲ型前胶原N端肽抗体的示踪标记物和示踪结合物稀释液；质控品为一低含量Ⅲ型前胶原N端肽的溶液和一高含量Ⅲ型前胶原N端肽的溶液，用于测定仪内储存主曲线的校正。

【技术特征摘要】
1.一种Ⅲ型前胶原N端肽定量测定试剂盒，包括测PⅢNP磁微粒、测PⅢNP示踪结合物、质控品，其特征在于：所述测PⅢNP磁微粒为标记有Ⅲ型前胶原N端肽单克隆抗体的磁性微球和磁微粒保存液；测PⅢNP示踪结合物为标记有Ⅲ型前胶原N端肽抗体的示踪标记物和示踪结合物稀释液；质控品为一低含量Ⅲ型前胶原N端肽的溶液和一高含量Ⅲ型前胶原N端肽的溶液，用于测定仪内储存主曲线的校正。2.根据权利要求1所述的一种Ⅲ型前胶原N端肽定量测定试剂盒，其特征在于：所述磁性微球为Fe2O3或Fe3O4磁性纳米粒子与有机高分子材料的复合体。3.根据权利要求2所述的一种Ⅲ型前胶原N端肽定量测定试剂盒，其特征在于：所述磁性微球通过表面改性而带有一种或多种活性功能基团，包括但不限于-OH，-COOH，-NH2，-CHO，-SO3H。4.根据权利要求1所述的一种Ⅲ型前胶原N端肽定量测定试剂盒，其特征在于：所述抗体为一种或多种单克隆抗体和/或多克隆抗体。5.根据权利要求1-4任意一项所述的一种Ⅲ型前胶原N端肽定量测定试剂盒，其特征在于：所述示踪标记物为鲁米诺和/或异鲁米诺及其衍生物。6.根据权利要求5所述的一种Ⅲ型前胶原N端肽定量测定试剂盒，其特征在于：所述磁微粒保存液和示踪物稀释液包括稳定剂、表面活性剂、防腐剂，包含但不限于TBS缓冲系统、HAC-NAC缓冲系统、PBS缓冲液系统、MES缓冲系统、HEPES缓冲系统，其缓冲能力为调节pH值6.0-8.5、浓度范围为0.01-0.2mol/L。7.一种权利要求5所述Ⅲ型前胶原N端肽定量测定试剂盒的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：1)磁微粒标记PⅢNP抗体的制备将带羧基的磁微粒与EDC分别按照1:1、1:2、1:3的重量比例进行混合后，按照每毫克磁微粒分别加入PⅢNP单抗15μg、20μg、25μg、30μg，分别在20℃、23℃、26℃反应1小时，加入甘氨酸，使甘氨酸浓度达到25mM，反应0.5小时，将标记好的磁微粒保存在含1％牛血清白蛋白的0.01M PBS中，于2-8℃贮存；2)异鲁米诺标记PⅢNP抗体的制备将异鲁米诺加入PⅢNP抗体中标记，戊二醛使用浓度分别为0.75％、1.0％、1.25％、1.5％，按照每毫克抗体分别加入异鲁米诺0.05mg、0.10mg、0.15mg、0.20mg，抗体与异鲁米诺的最佳标记比例为10：1，分别在20℃、23℃、26℃反应1.5小时，用PH7.2-7.4的0.01M PBS透析，透析后加入等体积甘油-20℃存放；3)测PⅢNP磁微粒的制备采用方阵滴定法确定磁微粒标记PⅢNP抗体的最适工作浓度，用磁微粒保存液进行稀释，混匀即...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒙红胜，乔文革，吴晗琪，王凌凌，王文艳，
申请(专利权)人：威海威高生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37