可实现GLT‑1蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒及测定方法技术

可实现GLT‑1蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒及测定方法,该试剂盒由标准物质和反应试剂两部分组成，标准物质包括：特征肽段及其内标肽段；反应试剂包括：碳酸氢铵、二硫苏糖醇、碘乙酰胺、胰蛋白酶、甲酸。通过将含谷氨酸转运体‑1蛋白样品与反应试剂按一定的体积比混合，经温育振荡，蛋白经变性、还原、乙酰化及酶解反应，得到最终产物，再将标准物质和/或最终产物分别注入（超）高效液相色谱‑三重四级杆质谱仪中，根据特征肽段母离子和子离子的质荷比（m/z）及特征肽段的保留时间（tR）进行定性鉴别，通过色谱峰面积变化测算出谷氨酸转运体‑1蛋白的绝对含量。

The kit can achieve 1 GLT protein identification and quantitative determination method and absolute

The kit can achieve 1 GLT protein identification and absolute quantification and measurement method, the kit comprises a standard material and reagent is composed of two parts, including the standard material: characteristics of peptides and their internal standard peptides; reagents including: ammonium bicarbonate, two dithiothreitol and iodoacetamide, trypsin, formic acid. The glutamate transporter containing 1 protein samples and reagent in certain volume ratio by incubation with protein by oscillation, degeneration, reduction, acetylation and hydrolysis reaction, the final product is obtained, then the standard substances and / or final products (super) were injected into the HPLC three level four tandem mass spectrometer, according to the characteristics of peptide parent ion and sub ion mass (m/z) and the characteristics of peptide retention time (tR) were identified by peak area changes, calculate the absolute content of glutamate transporter protein 1.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种可实现谷氨酸转运体-1蛋白鉴定及绝对定量的检测试剂盒及测定方法，属于检验测定

技术介绍
谷氨酸是中枢神经系统内兴奋性神经递质，当它被释放到突触间隙后，谷氨酸转运体-1能逆浓度梯度从胞外向胞内摄取谷氨酸，使突触间隙内谷氨酸浓度保持在较低水平，以保护神经元不受谷氨酸的兴奋性毒性影响。突触间隙中95％谷氨酸的摄取由星形胶质细胞膜上的谷氨酸转运体-1(glutamatetransporter-1/excitatoryaminoacidtransporter2，GLT-1/EAAT2)完成，谷氨酸转运体-1对清除突触间隙中的谷氨酸，终止谷氨酸能神经传递发挥主要作用。谷氨酸转运体-1分子量为73kDa，含573个氨基酸，有8～9个跨膜片段。国内外检测谷氨酸转运体-1蛋白的主要方法有酶联免疫吸附测定法(ELISA)和蛋白印迹法(westernblot)。ELISA法有特异性强的优点，但有易污染、背景值高的缺点；westernblot法为蛋白半定量方法，并且检测时间较长，这些方法常使检测灵敏度降低，不适合痕/微量谷氨酸转运体-1蛋白的检测。
技术实现思路
技术问题：本专利技术的目的是提供一种谷氨酸转运体-1蛋白检测试剂盒，给出一种采用本试剂盒可以克服现有技术缺点的谷氨酸转运体-1蛋白的定性鉴别和绝对定量的方法。该试剂盒给出了检测谷氨酸转运体-1蛋白的标准物质和对含谷氨酸转运体-1蛋白样品进行酶解反应的反应试剂。可将标准物质和/或酶解反应产物(或含内标物质)注入(超)高效液相色谱-三重四级杆质谱仪中进行谷氨酸转运体-1蛋白鉴定及含量测定。本专利技术提供了一种专属性强、精密度高、结果准确可靠、操作简便，可用于样品中谷氨酸转运体-1蛋白鉴定及含量测定的一种检测试剂盒及检测方法。技术方案：一种可实现GLT-1蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒，其特征在于：包括标准物质：标准物质包括特征肽段及其内标肽段，肽段序列为：选择方式如下：(1)、所述标准物质的特征肽段单独使用或者与其他特征肽段配成两种混合特征肽段使用；(2)、内标肽段单独使用，或与其他特征肽段配成两种或多种混合内标物质使用；(3)、所述标准物质的特征肽段与其内标肽段配成的单一内标物质单独使用，或与另外一种单一内标物质同时使用；(4)内标肽段与其他内标肽段混合使用。该试剂盒还包括反应试剂：反应试剂，由以下成分组成所述标准物质的内标肽段是特征肽段中任一、二或多个氨基酸上的C、H、O、N被同位素标记后的肽段，其中，一个氨基酸上的C、H、O、N四个元素可同时被标记，或任意1～3个元素被标记。所述标准物质配成单剂、双剂或多剂。所述胰蛋白酶为序列级胰蛋白酶、胰蛋白酶中的至少一种。所述反应试剂配成单剂。1)标准物质①标准物质是特征肽段，是单一标准物质，或配成多混合标准物质，使用其中的一种或多种；单一标准物质I特征肽段1VTLAANGK单一标准物质II特征肽段2TQSIYDDK双混合标准物质特征肽段1VTLAANGK特征肽段2TQSIYDDK②内标肽段，是单一内标肽段，或配成多混合内标肽段，使用其中的一种或多种；单一内标肽段I内标肽段1VTLAANGK单一内标肽段II内标肽段2TQSIYDDK双混合内标肽段内标肽段1VTLAANGK内标肽段2TQSIYDDK③将上述特征肽段与其内标肽段联合使用，是单一内标物质，或配成混合内标物质，使用其中的一种或多种；单一内标物质I特征肽段1VTLAANGK内标肽段1VTLAANGK单一内标物质II特征肽段2TQSIYDDK内标肽段2TQSIYDDK混合内标物质I特征肽段1VTLAANGK特征肽段2TQSIYDDK内标肽段1VTLAANGK混合内标物质II特征肽段1VTLAANGK特征肽段2TQSIYDDK内标肽段2TQSIYDDK混合内标物质III④标准物质是单剂、或是双剂或多剂，根据上述方法自由组合或选择其中的一种或多种。利用上述的可实现GLT-1蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒所实施的谷氨酸转运体-1蛋白含量测定方法，其特征在于：该方法步骤如下：(1)将待测样品加入碳酸氢铵，涡旋，加入二硫苏糖醇，温育振荡，再加入碘乙酰胺，温育振荡，放置至室温后，再加入胰蛋白酶，温育振荡，最后加入甲酸终止反应；(2)将标准物质和(1)步骤中最终酶解产物分别注入(超)高效液相色谱-串联四极杆质谱仪中检测，或将内标物质和(1)步骤中含内标肽段的最终酶解产物分别注入(超)高效液相色谱-三重四极杆质谱仪中检测，检测后通过母离子和子离子的质荷比(m/z)及特征肽段的保留时间(tR)进行定性鉴别，色谱峰峰面积变化测算出谷氨酸转运体-1蛋白的绝对含量；温度控制在25～60℃范围，温育时间控制在0.5～12h，振荡频率控制在800～2500rmp，涡旋时间控制在2～10min，室温控制在18-22℃范围；胰蛋白酶与被测样品总蛋白量比例控制在1/1到1/100。所述步骤(2)为：将特征肽段和(1)步骤中最终酶解产物分别注入(超)高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪中检测，或将混合内标物质和(1)步骤中含内标肽段的最终酶解产物分别注入(超)高效液相色谱-三重四极杆质谱仪中检测，通过m/z和tR进行定性，色谱峰峰面积变化测算出谷氨酸转运体-1蛋白的含量。有益效果：本专利技术具有的有益效果为：本专利技术提供的检测试剂盒和检测方法能对样品中谷氨酸转运体-1蛋白进行准确灵敏的定性和绝对定量，具有特异性强、灵敏度高、结果准确、操作简便等优点。本专利技术包括标准物质(由特征肽段及其内标肽段组成)和反应试剂；采用(超)高效液相色谱-三重四级杆质谱仪进行检测，这是一类采用高效液相色谱分离，三重四级杆质谱检测母离子和子离子m/z的设备，能快速、精确、灵敏的对脑组织中谷氨酸转运体-1蛋白进行定性鉴别和绝对定量。该方法具有操作简便、特异性强、灵敏度和准确度高的特点。目前，尚未开发出测定谷氨酸转运体-1蛋白含量的特征肽段及其内标肽段和反应试剂的试剂盒。本专利技术成功的弥补了生物检测领域的不足，能准确地对脑中谷氨酸转运体-1蛋白进行定性鉴别及绝对定量，具有特异性强、操作简便、灵敏度和准确度高的优点。附图说明图1为特征肽段1的二级质谱图(m/z＝387.2)图2为特征肽段1的二级质谱图(m/z＝485.2)。具体实施方式通过以下实施例进一步说明本专利技术，但本专利技术的权利要求不仅限于实施例。本专利技术包括谷氨酸转运体-1蛋白检测试剂盒和含量测定方法两部分。谷氨酸转运体-1蛋白检测试剂盒由标准物质和反应试剂两部分组成：1)标准物质①用以实现本专利技术试剂盒的标准物质是特征肽段，可以是单一标准物质，或配成多混合标准物质，可使用其中的一种或多种。单一标准物质I特征肽段1VTLAANGK单一标准物质II特征肽段2TQSIYDDK双混合标准物质特征肽段1VTLAANGK特征肽段2TQSIYDDK②用以实现本专利技术试剂盒的内标肽段，可以是单一内标肽段，或配成多混合内标肽段，可使用其中的一种或多种。单一内标肽段I内标肽段1VTLAANGK单一内标肽段II内标肽段2TQSIYDDK双混合内标肽段内标肽段1VTLAANGK内标肽段2TQSIYDDK③将上述特征肽段与其内标肽段联合使用，以下简称“内标物质”，更有利于谷氨酸转运本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可实现GLT‑1蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒，其特征在于：包括标准物质：标准物质包括特征肽段及其内标肽段，肽段序列为：选择方式如下：(1)、所述标准物质的特征肽段单独使用或者与其他特征肽段配成两种混合特征肽段使用；(2)、内标肽段单独使用，或与其他特征肽段配成两种或多种混合内标物质使用；(3)、所述标准物质的特征肽段与其内标肽段配成的单一内标物质单独使用，或与另外一种单一内标物质同时使用；(4)内标肽段与其他内标肽段混合使用。

【技术特征摘要】
1.一种可实现GLT-1蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒，其特征在于：包括标准物质：标准物质包括特征肽段及其内标肽段，肽段序列为：选择方式如下：(1)、所述标准物质的特征肽段单独使用或者与其他特征肽段配成两种混合特征肽段使用；(2)、内标肽段单独使用，或与其他特征肽段配成两种或多种混合内标物质使用；(3)、所述标准物质的特征肽段与其内标肽段配成的单一内标物质单独使用，或与另外一种单一内标物质同时使用；(4)内标肽段与其他内标肽段混合使用。2.根据权利要求1所述的可实现GLT-1蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒，其特征在于：该试剂盒还包括反应试剂：反应试剂，由以下成分组成3.根据权利要求1所述可实现GLT-1蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒，其特征在于：所述标准物质的内标肽段是特征肽段中任一、二或多个氨基酸上的C、H、O、N被同位素标记后的肽段，其中，一个氨基酸上的C、H、O、N四个元素可同时被标记，或任意1～3个元素被标记。4.根据权利要求1所述可实现GLT-1蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒，其特征在于：所述标准物质配成单剂、双剂或多剂。5.根据权利要求1所述可实现GLT-1蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒，其特征在于：所述胰蛋白酶为序列级胰蛋白酶、胰蛋白酶中的至少一种。6.根据权利要求2所述可实现GLT-1蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒，其特征在于：所述反应试剂配成单剂。7.根据权利要求1所述可实现GLT-1蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒，其特征在于：1)标准物质①标准物质是特征肽段，是单一标准物质，或配成多混合标准物质，使用其中的一种或多种；②内标肽段，是单一内标肽段，或配成多混合内标肽段，使用其...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜泓，封聪，袁明美，王守云，
申请(专利权)人：中国医科大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21