一种燕窝制品的实时荧光定量PCR鉴定试剂盒及其鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种燕窝制品的实时荧光定量PCR鉴定试剂盒及其鉴定方法。本发明专利技术所述的燕窝制品的实时荧光定量PCR鉴定试剂盒包括：序列为SEQ ID NO.1的正向引物；序列为SEQ ID NO.2的反向引物；序列为SEQ ID NO.3的TaqMan荧光探针；其中，所述TaqMan荧光探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记非荧光淬灭基团。本发明专利技术还提供了一种燕窝制品的实时荧光定量PCR鉴定方法。本方法具有直观、高度特异性、检测时速度快、步骤简单、重复性好、灵敏度高、可进行多重定量的特点，在燕窝制品的鉴定中有极强的操作性。

Real time fluorescent quantitative PCR identification kit for bird's nest products and identification method thereof

The invention discloses a real-time fluorescent quantitative PCR identification kit for bird's nest products and an identification method thereof. Real time fluorescent quantitative PCR identification kit of the invention of commercial products, including: the sequence of the forward primer SEQ ID NO.1; SEQ ID sequence primers for reverse NO.2; sequence TaqMan fluorescent probe SEQ ID NO.3; among them, the TaqMan fluorescent probe 5 'end labeled fluorescence report group, 3' end labeled non fluorescent quencher. The invention also provides a real-time quantitative PCR identification method for bird's nest products. The method has the advantages of direct viewing, high specificity, quick detection speed, simple steps, good repeatability, high sensitivity and multiple quantification, and has strong operability in the identification of bird's nest products.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种燕窝制品的鉴定方法，尤其是涉及一种燕窝制品的实时荧光定量PCR鉴定方法以及相关的试剂盒。
技术介绍
燕窝是雨燕科(Apodidae)金丝燕属(Collocalia)几种鸟类在繁殖期用分泌出的唾液或胃液与其自身的羽毛、杂草、苔藓等混合凝结而筑成的巢窝，凝结于人烟稀少的悬崖峭壁或岩洞之中。燕窝又称燕菜，最早在书籍《本草备要》记载为宜药宜膳的珍贵药材。现代临床试验证实燕窝有一定的药用价值，不仅是一种有效的预防流感病毒的“稀世名药”，也是营养价值极高的补品,物以稀为贵，故有“东方珍品”的美称。产可食用燕窝的金丝燕生活的特定区域位于马来西亚、印尼、越南等地及我国的福建、广东沿海地区。近年来，随着人们不断发现越来越多燕窝的功效，全球的燕窝产量呈稳定上升趋势。目前，燕窝的鉴别方法主要有理化鉴别、光谱鉴定、色谱鉴定、生物分子鉴定、感官鉴定及多种方法结合鉴定，这些方法存在准确性不高、灵敏度低、重现性差等特征。实时荧光定量PCR(RealtimePCR)技术具有高灵敏度、高重复性等特征，目前在生物制品的真伪检测方面发挥了重要作用。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种快速、敏感的检测和筛选真伪燕窝的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测燕窝的鉴定方法。本专利技术所述的燕窝制品的实时荧光定量PCR鉴定试剂盒包括：正向引物，序列为5’-TGAATTGAGCCTGTCGTCTG-3’(SEQIDNO.1)；反向引物，序列为5’-TGCTCCATAGCCAAACAAGA-3’(SEQIDNO.2)；TaqMan荧光探针，序列为5’-FAM-ATGCTGTCTCTTTCCTCAGGA-TAMRA-3’(SEQIDNO.3)；其中，所述TaqMan荧光探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记非荧光淬灭基团。根据本专利技术所述的燕窝制品的实时荧光定量PCR鉴定试剂盒的进一步特征，所述荧光报告基团是FAM，所述非荧光淬灭基团为TAMRA。本专利技术还提供了一种燕窝制品的实时荧光定量PCR鉴定方法。本专利技术所述的燕窝制品的实时荧光定量PCR鉴定方法包括以下步骤：提供本专利技术所述的实时荧光定量PCR鉴定试剂盒；根据所述试剂盒，配制一定组分浓度的25μLPCR反应体系；提取待测的燕窝制品的DNA，加入到反应体系中，进行实时荧光定量PCR反应；收集荧光信号，检测Ct值。根据本专利技术所述的燕窝制品的实时荧光定量PCR鉴定方法的进一步特征，所述25μLPCR反应体系包括：根据本专利技术所述的燕窝制品的实时荧光定量PCR鉴定方法的进一步特征，所述实时荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性15s，60℃退火45s，60℃延伸35s，40个循环，终末延伸60℃5min。1)样本用裂解液和DNA抽提液处理，提取燕窝样本DNA；2)实时荧光定量PCR反应，配制一定组分浓度的25μLPCR反应体系，混匀后短暂离心分装到PCR管中；3)将待测样品加入到反应体系中，进行扩增；4)收集荧光信号，检测Ct值。进一步，所述实时荧光定量PCR反应的体系组分及其体积如下：扩增条件：采用本领域的标准扩增条件。本专利技术的有益效果在于：采用TaqMan探针实时荧光定量PCR(Real-timePCR)检测燕窝的鉴定方法，该鉴定方法包括设计一对引物和探针对待检样本进行实时定量检测，通过特异性扩增金丝燕的12SrRNA基因序列对燕窝制品进行鉴定，扩增的DNA片段大小为144bp。本专利技术利用了PCR对DNA的高效扩增，探针技术的高特异性和光谱技术的敏感性以及定量的特点，克服常规PCR检测的不足，具有直观、高度特异性、检测时速度快、步骤简单、重复性好、灵敏度高、可进行多重定量的特点。在实际快速诊断中有极强的操作性。附图说明图1燕窝基因片段实时荧光定量PCR扩增曲线；具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐释本专利技术。应当理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。以下实施例中所使用的引物和探针序列如下：正向引物，序列为5’-TGAATTGAGCCTGTCGTCTG-3’(SEQIDNO.1)；反向引物，序列为5’-TGCTCCATAGCCAAACAAGA-3’(SEQIDNO.2)；TaqMan荧光探针，序列为5’-FAM-ATGCTGTCTCTTTCCTCAGGA-TAMRA-3’(SEQIDNO.3)；实施例1：1.待检样品为燕窝样品的DNA提取液，阳性对照为血燕血液的DNA提取液，阴性对照为DNase-FreeWater。2.燕窝样品的DNA提取：按QIPromega试剂盒使用说明书提取样品DNA。具体操作步骤如下：①称量：用洁净镊子和剪刀取得适量燕窝，剪碎，用电子分析天平称量，将剪碎的燕窝样品分别置于2ml离心管中，做好标记；②裂解：向装有燕窝样品的离心管中分别加入500l核酸裂解液，使其充分浸泡裂解样品；使用涡旋振荡器混匀后于恒温加热器以65(±2)℃温浴15min；③除RNA：向各离心管液面分别加入2ulRNase溶液，反复吹打混匀；于恒温加热器以37(±2)℃温浴15min，继续下一步骤前需室温冷却放置5min；④除蛋白：向各离心管中分别加入200l蛋白沉淀液后，使用涡旋振荡器振荡30s，充分混匀；使用微量离心机以13000-16000r/min离心2min，转移上清至另一洁净2ml离心管中；向装有上清的离心管中分别加入500lTris饱和酚，使用涡旋振荡器振荡30s混匀；使用微量离心机以13000-16000r/min离心2min，转移上清；再次除去蛋白，蛋白质难以一步完全除去；向装有上清的离心管中分别加入500l氯仿溶液，颠倒混匀离心管数次；使用微量离心机以13000-16000r/min高速离心2min，转移上清；⑤向各离心管分别加入与上清液等体积的异丙醇溶液，轻柔颠倒混匀；将离心管于冰箱-20℃静置10min，冷冻析出并沉淀DNA；使用微量离心机以13000-16000r/min离心3min后，小心地弃去上清液；⑥洗涤：向各离心管中分别加入500l的70％乙醇溶液，倾斜并轻轻转动离心管数圈；使用微量离心机以13000-16000r/min快速离心1min后，小心地弃去洗涤液，可在离心管底部发现小团略透明白色DNA沉淀；打开离心管管盖，管口向下，用吸水纸吸收并室温晾干管内液体，需要约1-2小时；⑦溶解：向已晾干的离心管中加入50lTE缓冲液，用移液枪反复吹打溶解DNA，于冰箱4℃保存备用；3.配制反应体系每个反应管中包含以下试剂：在1.5mL离心管中配制4个除模板DNA外的体系，混匀后短暂离心分装到3个PCR反应管中，分别加入阴性对照、待检样品DNA、阳性对照。4.上机，在如下条件下进行扩增，95℃预变性5min，95℃变性15s，60℃退火45s，60℃延伸35s，40个循环，终末延伸60℃5min。扩增条件：采用本领域的标准扩增条件。5.收集荧光信号，检测Ct值。6.结果判断：根据阳性对照，阴性对照Ct值判断。当Ct值小于等于37时，即判断为阳性。如图1所示为燕窝样品扩增曲线。实施例2：按照实施例1处理方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种燕窝制品的实时荧光定量PCR鉴定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：序列为SEQ ID NO.1的正向引物；序列为SEQ ID NO.2的反向引物；序列为SEQ ID NO.3的TaqMan荧光探针；其中，所述TaqMan荧光探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记非荧光淬灭基团。

【技术特征摘要】
1.一种燕窝制品的实时荧光定量PCR鉴定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：序列为SEQIDNO.1的正向引物；序列为SEQIDNO.2的反向引物；序列为SEQIDNO.3的TaqMan荧光探针；其中，所述TaqMan荧光探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记非荧光淬灭基团。2.根据权利要求1所述的燕窝制品的实时荧光定量PCR鉴定试剂盒，其特征在于：所述荧光报告基团是FAM，所述非荧光淬灭基团为TAMRA。3.一种燕窝制品的实时荧光定量PCR鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：提供如权利要求1所述的实时荧光定量PCR鉴定试剂盒；根据所述试剂盒，配制一定组分浓度的25μLPCR反应体系；提取...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘艳清，唐文武，蔡璇，李德安，汪洪武，
申请(专利权)人：肇庆学院，
类型：发明
国别省市：广东;44