镰刀菌病病原菌RT-PCR检测引物和探针组合及试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种镰刀菌病病原菌实时荧光定量PCR检测引物和探针组合及试剂盒。所述引物和探针组合的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1‑12所示。本发明专利技术的试剂盒能够快速、特异、灵敏、稳定对角膜镰刀菌病病原菌进行分子诊断。在建立了可靠的镰刀菌病病原菌检测体系的基础上，本发明专利技术针对性地设计了竞争性内参，确保阴性结果的真实可信。同时，本发明专利技术提供的试剂盒包含改良的DNA提取体系，能快速有效地完成DNA提取过程，使检测更为快捷方便。

【技术实现步骤摘要】
镰刀菌病病原菌RT-PCR检测引物和探针组合及试剂盒
本专利技术属于微生物检测
，具体地说，涉及镰刀菌病病原菌实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测引物和探针组合及试剂盒。
技术介绍
真菌性角膜炎是一种世界范围内常见的致盲性眼病，多见于包括中国在内的农业人口为主的发展中国家。其中，又以镰刀菌属真菌引起的角膜镰刀菌病最为常见。统计资料表明，同仁医院眼科研究所报告的775例真菌性角膜炎中，角膜镰刀菌占58.7％，其病原菌以茄病镰刀菌、串珠镰刀菌和尖孢镰刀菌为主。近年来，随着广谱抗生素、皮质激素、免疫抑制剂和抗肿瘤药物的广泛应用，角膜镰刀菌病的发病率有较明显的上升趋势。角膜镰刀菌病起病缓慢，外用抗生素无效，早期主要症状包括疼痛、畏光、红肿、视力模糊，如治疗不及时，可以引起角膜穿孔，导致失明。因此，真菌性角膜炎的早期诊断对防盲、治盲意义重大，只有早期及时确诊，才能合理治疗。目前，临床上常用的诊断方法包括镜检、培养、共聚焦显微镜检查、组织病理检查等。但除培养外，都不能达到真菌鉴定到种水平。而真菌培养，耗时过长，一般需1-2周，不适用于临床早期诊断。因此，开发精准的分子诊断技术，用于对角膜镰刀菌病的诊疗，有着非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种镰刀菌病病原菌实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测引物和探针组合及试剂盒。本专利技术的另一目的是提供一种用于非疾病诊断目的检测镰刀菌病病菌的方法。本专利技术的再一目的是提供一种改良的真菌DNA提取液。为了实现本专利技术目的，本专利技术的镰刀菌病病原菌实时荧光定量PCR检测引物和探针组合，该组合包括：(I)用于检测镰刀菌的通用引物和探针，所述镰刀菌包括茄病镰刀菌、串珠镰刀菌和尖孢镰刀菌(SEQIDNO:1-3)Fpan-F：5′-GCCCGAGTTGTAATTTGTAGAG-3′Fpan-R：5′-AACCAGACGGGGCTCTCAC-3′Fpan-P：5′-FAM-GGTGCCTTCCGAGTTCCCTGG-BHQ1-3′(II)用于检测串珠镰刀菌的特异性引物和探针(SEQIDNO:4-6)Fmon-F：5′-CGCATGAGTGTTTACTTCAACG-3′Fmon-R：5′-AGGTCGACGAGGACGGCT-3′Fmon-P：5′-FAM-AGCAGTCAA[T]G[T]CAAGAGTTCA-BHQ1-3′；其中，[T]表示锁核酸；(III)用于检测茄病镰刀菌的特异性引物和探针(SEQIDNO:7-9)Fsol-F：5′-GCATGAGCGTCTACTTCAAC-3′Fsol-R：5′-AAGGGACCAGCACGAACG-3′Fsol-P：5′-FAM-AGCTGACATCTGTAGGCTTCTGGTAA-BHQ1-3′；以及(IV)用于检测尖孢镰刀菌的特异性引物和探针(SEQIDNO:10-12)Foxy-F：5′-TGTCTACTTCAACGAGGTATGC-3′Foxy-R：5′-CATGGTACCAGGCTCAAGAT-3′Foxy-P：5′-FAM-AATTCCCAAGCTCACACAACTAGG-BHQ1-3′。本专利技术还提供与上述引物和探针组合配套使用的竞争性内参模板(SEQIDNO:13-15)和内参探针(SEQIDNO:17)。本专利技术还提供含有所述引物和探针组合的用于实时荧光定量PCR检测镰刀菌病病原菌的试剂盒。所述试剂盒还包括竞争性内参模板Fpan-IAC、Fmon-IAC、Fsol-IAC、Foxy-IAC和内参探针Fu-IACP，其序列信息如下：Fpan-IAC：5′-GCCCGAGTTGTAATTTGTAGAGCTAGATGACTGAGCACGTCTATCCGATGATCATGGTGAGAGCCCCGTCTGGTT-3′(SEQIDNO:13)Fmon-IAC：5′-CGCATGAGTGTTTACTTCAACGCTAGATGACTGAGCACGTCTATCCGATGATCATGAGCCGTCCTCGTCGACCT-3′(SEQIDNO:14)Fsol-IAC：5′-GCATGAGCGTCTACTTCAACCTAGATGACTGAGCACGTCTATCCGATGATCATGCGTTCGTGCTGGTCCCTT-3′(SEQIDNO:15)Foxy-IAC：5′-TGTCTACTTCAACGAGGTATGCCTAGATGACTGAGCACGTCTATCCGATGATCATGATCTTGAGCCTGGTACCATG-3′(SEQIDNO:16)Fu-IACP：5′-TAMRA-ACTGAGCACGTCTATCCGA-BHQ1-3′(SEQIDNO:17)。所述试剂盒进一步包括真菌DNA提取液和/或玻璃珠等；所述真菌DNA提取液的配方如下：800mMTris-HClpH9.5200mMEDTApH8.0100mMNaHCO3300mMKCl所述玻璃珠优选为直径710-1180μm的酸洗玻璃珠。本专利技术还提供一种用于非疾病诊断目的检测镰刀菌病病菌的方法，包括以下步骤：1)提取待测样品的DNA；2)以上述提取的DNA为模板，利用本专利技术的试剂盒，分别进行实时荧光定量PCR扩增；3)分析PCR扩增产物。实时荧光定量PCR扩增反应体系的配制如下：(1)依次配制如下试剂①PCRmixtureA，配方如下：②PCRmixtureB，配方如下：③PCRmixtureC，配方如下：④PCRmixtureD，配方如下：⑤PCRmixtureE，配方如下：(2)镰刀菌检测体系的配制取15μl的PCRmixtureA和13μl的PCRmixtureB混合，加入2μlDNA模板，即得；(3)串珠镰刀菌检测体系的配制取15μl的PCRmixtureA和13μl的PCRmixtureC混合，加入2μlDNA模板，即得；(4)茄病镰刀菌检测体系的配制取15μl的PCRmixtureA和13μl的PCRmixtureD混合，加入2μlDNA模板，即得；(5)尖孢镰刀菌检测体系的配制取15μl的PCRmixtureA和13μl的PCRmixtureE混合，加入2μlDNA模板，即得。实时荧光定量PCR扩增反应程序如下：95℃10min；95℃15s，54℃20s，72℃30s(采集数据)，共40个循环。前述方法中，步骤3)根据是否出现扩增曲线，分析待测样品中是否含有相应的镰刀菌病病原菌；含有病原菌的待测样品会出现对应的扩增曲线，表现为阳性结果；不含有病原菌的待测样品不出现扩增曲线或扩增曲线在检测阈值之下，表现为阴性结果。本专利技术提供一种能快速、稳定地组织标本中提取核酸的方法，具体如下：S1、采集待测样本100-500mg加入2ml离心管中，向离心管中加入600μl真菌DNA提取液和0.5g玻璃珠，在TissueLyserII(Qiagen公司)上30Hz震荡10min，或涡旋震荡10min；S2、95℃温育10min，14000rpm离心5min，取上清，作为DNA模板。可将上述提取核酸的方法用于非疾病诊断目的检测镰刀菌病病菌方法的步骤1)。本专利技术提供的镰刀菌病病原菌实时荧光定量PCR检测引物和探针组合及试剂盒，能够快速、特异、灵敏、稳定对镰刀菌病病原菌进行分子诊断。在本文档来自技高网...

【技术保护点】
镰刀菌病病原菌RT‑PCR检测引物和探针组合，其特征在于，该组合包括：(I)用于检测镰刀菌的通用引物和探针，所述镰刀菌包括茄病镰刀菌、串珠镰刀菌和尖孢镰刀菌Fpan‑F：5′‑GCCCGAGTTGTAATTTGTAGAG‑3′Fpan‑R：5′‑AACCAGACGGGGCTCTCAC‑3′Fpan‑P：5′‑FAM‑GGTGCCTTCCGAGTTCCCTGG‑BHQ1‑3′(II)用于检测串珠镰刀菌的特异性引物和探针Fmon‑F：5′‑CGCATGAGTGTTTACTTCAACG‑3′Fmon‑R：5′‑AGGTCGACGAGGACGGCT‑3′Fmon‑P：5′‑FAM‑AGCAGTCAA[T]G[T]CAAGAGTTCA‑BHQ1‑3′；其中，[T]表示锁核酸；(III)用于检测茄病镰刀菌的特异性引物和探针Fsol‑F：5′‑GCATGAGCGTCTACTTCAAC‑3′Fsol‑R：5′‑AAGGGACCAGCACGAACG‑3′Fsol‑P：5′‑FAM‑AGCTGACATCTGTAGGCTTCTGGTAA‑BHQ1‑3′；以及(IV)用于检测尖孢镰刀菌的特异性引物和探针Foxy‑F：5′‑TGTCTACTTCAACGAGGTATGC‑3′Foxy‑R：5′‑CATGGTACCAGGCTCAAGAT‑3′Foxy‑P：5′‑FAM‑AATTCCCAAGCTCACACAACTAGG‑BHQ1‑3′。...

【技术特征摘要】
1.镰刀菌病病原菌RT-PCR检测引物和探针组合，其特征在于，该组合包括：(I)用于检测镰刀菌的通用引物和探针，所述镰刀菌包括茄病镰刀菌、串珠镰刀菌和尖孢镰刀菌Fpan-F：5′-GCCCGAGTTGTAATTTGTAGAG-3′Fpan-R：5′-AACCAGACGGGGCTCTCAC-3′Fpan-P：5′-FAM-GGTGCCTTCCGAGTTCCCTGG-BHQ1-3′(II)用于检测串珠镰刀菌的特异性引物和探针Fmon-F：5′-CGCATGAGTGTTTACTTCAACG-3′Fmon-R：5′-AGGTCGACGAGGACGGCT-3′Fmon-P：5′-FAM-AGCAGTCAA[T]G[T]CAAGAGTTCA-BHQ1-3′；其中，[T]表示锁核酸；(III)用于检测茄病镰刀菌的特异性引物和探针Fsol-F：5′-GCATGAGCGTCTACTTCAAC-3′Fsol-R：5′-AAGGGACCAGCACGAACG-3′Fsol-P：5′-FAM-AGCTGACATCTGTAGGCTTCTGGTAA-BHQ1-3′；以及(IV)用于检测尖孢镰刀菌的特异性引物和探针Foxy-F：5′-TGTCTACTTCAACGAGGTATGC-3′Foxy-R：5′-CATGGTACCAGGCTCAAGAT-3′Foxy-P：5′-FAM-AATTCCCAAGCTCACACAACTAGG-BHQ1-3′。2.含有权利要求1所述引物和探针组合的用于实时荧光定量PCR检测镰刀菌病病原菌的试剂盒。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括竞争性内参模板Fpan-IAC、Fmon-IAC、Fsol-IAC、Foxy-IAC和内参探针Fu-IACP，其序列信息如下：Fpan-IAC：5′-GCCCGAGTTGTAATTTGTAGAGCTAGATGACTGAGCACGTCTATCCGATGATCATGGTGAGAGCCCCGTCTGGTT-3′Fmon-IAC：5′-CGCATGAGTGTTTACTTCAACGCTAGATGACTGAGCACGTCTATCCGATGATCATGAGCCGTCCTCGTCGACCT-3′Fsol-IAC：5′-GCATGAGCGTCTACTTCAACCTAGATGACTGAGCACGTCTATCCGATGATCATGCGTTCGTGCTGGTCCCTT-3′Foxy-IAC：5′-TGTCTACTTCAACGAGGTATGCCTAGATGACTGAGCACG...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚杰，张雯，吴伟伟，陈见友，陆捷洁，韩娜，张婷婷，黎青山，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，
类型：发明
国别省市：北京,11