快速并灵敏基因型鉴定及核酸检测制造技术

本发明专利技术公开了用于鉴定各种基因突变或物质基因分型的方法、引物、探针和试剂盒。在一个实施例中，所述物质是致病的。在另一个实施例中，本发明专利技术应用于检测多重耐药性结核分枝杆菌，乙肝病毒，β‑球蛋白突变，与血栓形成倾向有关的突变；或多种性病病原体，包括但不局限于，阴道毛滴虫、衣原体、淋球菌、支原体、人型支原体、解脲支原体、解孢子虫、梅毒螺旋体、单纯疱疹病毒1型和2型和人乳头瘤病毒6型和11型。

Rapid and sensitive genotype identification and nucleic acid detection

Methods, primers, probes, and kits for identifying various gene mutations or substance gene types are disclosed. In one embodiment, the substance is pathogenic. In another embodiment, the invention is applied to the detection of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis, hepatitis B virus, beta globulin mutation, mutation and the tendency of the formation of thrombosis; or a variety of pathogens of sexually transmitted diseases, including but not limited to, Trichomonas vaginalis, Neisseria gonorrhoeae, chlamydia, mycoplasma and Ureaplasma urealyticum and the solution of Cryptosporidium, syphilis, herpes simplex virus type 1 and type 2 and human papillomavirus type 6 and type 11.

【技术实现步骤摘要】
快速并灵敏基因型鉴定及核酸检测本申请是2014年3月17日申请的PCT国际申请PCT/CN2014/000275于2015年11月3日进入中国国家阶段的、申请号为201480027795.3且专利技术名称为“快速并灵敏基因型鉴定及核酸检测”的专利技术专利申请的分案申请。相关申请本申请要求以2013年3月15日提交的美国临时专利申请号61/791,933为优先权基础，所述专利申请的所有内容都以引用方式被纳入本申请中。
本专利技术涉及的领域在于鉴定与人类疾病有关的各种基因型。
技术介绍
本专利技术涉及识别不同基因型。序列特异性引物-聚合酶链式反应(SSP-PCR)、DNA测序、DNA指纹，和单核苷酸多态性(SNP)基因分型等技术，已被应用于基因分型(PCT申请公开号WO/2011/139750)。在这些技术中，单核苷酸多态性(SNP)基因分型有较高的识别力。然而，大多数涉及DNA杂交的基因分型检测都要求较高的运行成本和较长的操作时间，因此有必要开发更有效的基因分型方法，达至更快、更便宜及覆盖更多基因型。结核分枝杆菌(MTB)检测结核病(TB)是由结核分枝杆菌(MycobacteriumtuberculosisMTB)引起的。耐药性结核分枝杆菌(DR-MTB)的出现是在工业化国家和发展中国家结核病控制项目中的一个严重问题。除了在临床和流行病学上的重要性，耐药性结核病(DR-MTB)更有重要的经济影响，因其治疗成本比普通的MTB为高。DR-MTB被定义为对至少两个最有效的第一线药物有耐药性，包括利福平(rifampinRIF)和异烟肼(isoniazidINH)。DR-MTB病例在全球有上升的趋势，显着的发病率和死亡率。一线抗结核药物的耐药性已被发现与几个MTB基因突变有关：rpoB(耐RIF)；katG基因和inhA基因(耐INH)。DR-MTB的检测有几种不同技术可用。虽然传统的表型药物敏感性试验(DST)仍然是测试MTB耐药性的“黃金标准”，但DST可能要长达八个星期才能完成。结核分枝杆菌是生长缓慢的细菌。MTB每15-20小时才分裂一次，并取决于所使用的介质一般需要4至6周才能生长成菌落。此后，当DST所培养的MTB被识别，药敏试验通常再还需时2周。DST因此需要较长时间，导致了治疗疾病的延误，尤其通常的做法是在DST完成前已经要开始治疗。业界开发中的替代培养或能缩短测试所需的时间；然而，某些类型样品中的MTB不适合用替代培养。商业环境中并不经常使用常规的DNA测序来检测MTB耐药突变，因为其耗时和需要专门的知识。市场上有不同技术的试剂盒，包括实时PCR和用于检测单一类型MTB或耐药性MTB的常规杂交。特别是实时PCR，由于其可用信道数量有限，所以通常难以同时检测多种耐药MTB。虽然常规杂交也适用于检测多药耐药MTB；然而，它需要长的温育时间(至少4小时)。对比下，本专利技术通过利用聚合酶链反应(PCR)和“导流”杂交技术，提供了一种阵列测试，可以在一个平台上同时检测单一耐药MTB和多重耐药MTB，检测时间比常规的杂交短(～35分钟)。从提取样品中DNA到分析的整个测试只需少于4小时，检测结果有高度的特异性和敏感性。β地中海贫血的检测β地中海贫血由常染色体突变引起，是一种血红蛋白疾病，可根据β-球蛋白的生产受影响的程度再分类。其中有些突变导致β球蛋白(表示为β+)轻度减产，有些导致β-球蛋白基因的绝对沉默而不能生产或只生产出失去功能的β球蛋白(表示为β0)。据估计，世界约有1.5％的人口有β-地中海贫血基因型的杂合体，父母都是杂合体的话其后代可能是纯合体。β地中海贫血有三个严重程度：轻度(轻型地中海贫血，β+/β或β0/β)、中度(中度地中海贫血：β+/β或β0/β)和严重(重型地中海贫血：β+/β+，β0/β+或β0/β0)。遗传了地中海贫血的人主要会出现低色素性贫血，并可能需要终身输血。控制β-地中海贫血的最好方法是避免β地中海贫血患儿的出生，这要准父母做产前检测和遗传咨询；这已被证实是最有效管理地中海贫血的方法。β-地中海贫血流行于温带地区，如地中海沿岸国家，中东和东南亚地区。β-地中海贫血的分子基础已有被广泛研究，发现β-球蛋白基因的点突变在不同的地区有不同的突变方式和突变频率。当前的检测技术包括微阵列，等位基因特异性PCR(AS-PCR)和直接测序。微阵列可以同时检测多个目标DNA芯片上，因此适用于同时检测多个样品。然而，它的应用是因其高成本的限制，结果不能用肉眼观察，需使用高性能扫描器和复杂的分析软件进行解释。等位基因特异性PCR是使用等位基因特异性引物，以检测多态性或突变，这技术中只有与目标DNA完全匹配的寡核苷酸能够充当引物以扩增目标DNA。该技术的限制是在一个反应的有限的吞吐量。直接DNA测序涉及体外DNA复制过程其中DNA聚合酶选择性地掺入链终止双脱氧核苷酸，该技术的吞吐量低和需要长时间操作，因此检测效率低。另一方面，本专利技术提供了一种结合使用PCR和反向斑点杂交的DNA检测,能够提供了一个高度敏感和特异的检测的β-球蛋白基因的突变，以协助β-地中海贫血的检测。乙型肝炎病毒检测乙型肝炎病毒是最小的DNA病毒，其包括3000个由蛋白质衣壳围绕的核苷酸。乙型肝炎病毒通过与受感染者的血液或体液接触传播。约二十亿人感染乙肝病毒；其中超过3.5亿成为乙肝病毒携带者。大约五分之一乙型肝炎病毒感染会发展出肝硬化或肝癌。检测乙型肝炎病毒可以通过简单的表面抗原血液测试，或使用应用聚合酶链反应(PCR)和乙型肝炎病毒DNA的测量进行诊断。此外，通过分析乙型肝炎病毒基因组序列的差异已鉴定了10种乙型肝炎病毒基因型(A至J)和几种亚型。乙型肝炎病毒基因型和亚型明显表现出不同的地域分布。各种乙型肝炎病毒基因型在致病和治疗上存在差异。乙型肝炎病毒基因型的确定可以为慢性乙型肝炎病毒感染和治疗前的评估提供信息。DNA测序被认为是对乙型肝炎病毒基因型检测的黃金标准方法。但它在检测混合基因型的效率较低。另外，分子DNA技术提供了一个用于高度敏感地检测乙型肝炎病毒基因型的具体方法。性病病原体检测性病是常见的世界性疾病。根据2005年世界卫生组织估计，每年有448万新发并可治愈的性病病例(梅毒，淋病，衣原体和滴虫)，主要发生在世界各地的15至49岁的成年人。香港在2010年每550个孕妇有一个被检测出患有性传播疾病(不包括艾滋病)。性病能传染孕妇的孩子，无论是在怀孕期间或在宝宝出生后。当中，淋球菌和衣原体可导致不育。因此，准婚夫妇和孕前妇女有检测性病的潜在需要。此外，中国也是检测性病病原体的潜在市场，在过去20年性病患者数量急剧增加。因此中国需要快速，低价，准确的性病病原体检试剂盒帮助控制性病。目前市场上的性病检试剂盒可用于检测单个病原体或同时检测3-4个病原体，一般没有包括人类乳头状瘤病毒(HPV)。由于性病的发病率增加，有需要同时筛选分析和检测多个性病病原体。血栓形成倾向检测血栓形成倾向是指血液有异常的凝固，增加了出现血栓形成的风险。研究报告显示，有血栓形成倾向并出现血栓形成的病人中,约40％与遗传因素有关，并且被证实有较高风险患上静脉血栓形成等心血管疾病和复发性流产等生殖障碍。也有越来越多的意见认为带有遗传性血栓形成倾本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测受试者是否存在性病病原体的方法，包含以下步骤：(a)从所述受试者获得包含模板核酸分子的样本；(b)使用序列号为263‑286的引物扩增所述模板核酸分子，从而得到扩增产物；和(c)将所得的扩增产物与序列号为287‑298的寡核苷酸探针杂交，所得杂交结果显示受试者是否存在性病病原体。

【技术特征摘要】
2013.03.15 US 61/7919331.一种用于检测受试者是否存在性病病原体的方法，包含以下步骤：(a)从所述受试者获得包含模板核酸分子的样本；(b)使用序列号为263-286的引物扩增所述模板核酸分子，从而得到扩增产物；和(c)将所得的扩增产物与序列号为287-298的寡核苷酸探针杂交，所得杂交结果显示受试者是否存在性病病原体。2.根据权利要求1所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭约瑟夫荣安，周约瑟夫国辉，郭秀梅，杨温迪颖珊，朱丽安，
申请(专利权)人：达雅高生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：中国香港,81