识别基因型的方法技术

本发明专利技术涉及一种识别基因型的方法以及采用该方法来识别基因型所用的基因型识别用试剂盒，其中，所述识别基因型的方法中利用了PCR-PHFA法，并且包括下述核酸扩增工序和识别工序：核酸扩增工序，通过核酸扩增反应对具有试样中所含基因中的突变位点的区域进行扩增，获得含有试样双链核酸的扩增反应液；识别工序，通过将上述核酸扩增工序中所获得的扩增反应液与上述突变位点为特定基因型并且由标记物质所标记的标准双链核酸进行混合而发生竞争性链置换反应，并通过测定标准双链核酸与试样双链核酸之间链置换的发生程度来识别上述标准双链核酸与上述试样双链核酸的同一性；并且，上述竞争性链置换反应是在抑制聚合酶延伸反应的条件下进行。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种基因多态性或体细胞突变等基因型的识别方法以及该方法中所用的试剂盒，更详细而言，涉及一种改善以利用了链置换反应的竞争性杂交来识别核酸碱基序列微小差异的方法的识别精度的方法，以及该方法中所用的试剂盒。本申请是基于2009年3月31日在日本提出的“特愿2009-084967号”要求优先权，并在此将其内容援引到本申请中。
技术介绍
通过人类基因组的解读、尤其是通过制作SNP (Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性)图谱的国际人类基因组单体型图计划，有关人类基因组的信息日趋增加。并且，在全世界范围内已经大规模开展以实现下述“对应于个人遗传信息的医疗”(量身定制式医疗)作为目标的研究通过发现所获得的基因组信息与个人体质之间的关联，掌握基因水平上的个人体质差别，可对应于个人特性进行疾病诊断、治疗、预防或施药。这里的基因差别，意指每个人的基因组碱基序列上的差别，其主要差别是单核苷酸的差别(SNP(单核苷酸多态性))。另外，最近，已了解短碱基序列的重复次数(拷贝数)的差别(拷贝数变异(Copy Number Variation,CNV))也广泛存在于全基因组中，并指出了该 CNV的差别与疾病之间的关联性。在此，为了掌握个人在基因水平上的差别，有必要调查每个人的基因型。例如，已知在某SNP中，其基因型为AA、AG、GG三种。A表示腺嘌呤、G表示鸟嘌呤碱基，该SNP是基因组位置有腺嘌呤时和鸟嘌呤时的一个例子。因此，为识别该SNP的基因型的检查，就是要确定是该三种基因型中的哪一种。即，只要发现A是0和100中的哪一个、G是0和100中的哪一个或者A和G是否为50和50即可。如此，SNP等生殖细胞突变的检测，基本可以说是定性的检测，该方法中较容易的、简便的各种方法得到实用化。另一方面，在癌细胞中，在体细胞水平上发生突变并且该突变成为癌的诱因而与异常增殖有关。因此，在某特定种类的癌细胞中，有时会出现特定基因的突变，可以将该突变作为指标进行癌细胞的检测。但是，癌细胞富有多样性，根据一种突变来确定癌细胞则未必容易。另外，在最近的药物疗法中，开发了以生物体内特定的分子(蛋白质等)作为目标的药剂，且发现了副作用少、效果高的药剂。它们被称作分子靶向药物，主要在癌治疗领域中得到积极的开发。最近，明确了在这些分子靶向药物中，当作为靶标的分子的信号传递的下游蛋白质中发生突变时，则该药剂的效果得不到发挥等。此时，通过调查对发生有突变的蛋白质进行编码的基因的突变，可以预测该药剂的效果，不断开拓与SNP检测不同的新型 “量身定制式医疗”的领域。在此所述的癌细胞中的特征性突变或者对分子靶向药物显示抵抗性的突变，几乎都是体细胞突变。在前述的生殖细胞突变时在所有细胞中均发现相同的突变，与此相对，在体细胞突变中只在引起突变的细胞中发现突变，在未引起突变的细胞(通常为正常细胞)中未发现突变。因此，通常在标本(作为检查对象的试样)中处于突变细胞和正常细胞相混合的状态，对应于这些细胞的丰度比(abundance ratio)，存在有突变基因和正常基因。即， 若试样的大部分是正常细胞而含有部分突变细胞，则不得不从大量正常基因中检测出所存在的少许突变基因，而这就是与生殖细胞中的突变检测的不同点，使体细胞的基因变异检测变得更加困难。在体细胞的基因变异检测法中，大致分为两种方法。其中，一种是在基因扩增阶段区别正常基因和突变基因的方法，具体而言，只对突变基因进行特异性扩增的方法。例如，作为灵敏度最好的方法，是用限制酶只对正常基因进行切割并只对未切割的突变基因进行扩增的、被称作“mutant-enriched PCR(突变体富集PCR) ”的方法(例如， 参照非专利文献1)。在该方法中，通过反复进行扩增突变基因的反应，可以从正常基因IO6 分子中检测出1分子的突变基因(例如，参照非专利文献幻。该方法在这种所谓高灵敏度的方面优良，但操作非常繁杂，并不是可以适用于通常的诊断中的方法。另外，开发了一种在PCR等的引物的延伸反应中通过区分单核苷酸的差别进行扩 ±曾的方法。该方法是被称作 “ARMS (amplification refractory mutation system,扩增抑制突变系统)”(例如，参照非专利文献3)、“ASPCR(allele specific PCR，等位基因特性 PCR) ”(例如，参照非专利文献4)等的方法。该方法是一种具有以下所述优点的方法灵敏度较高，不需要再进行除通常PCR扩增反应以外的操作，可以在封闭系统中进行全部反应且非常简便，不存在PCR残留污染(交叉污染)。但是，但凡有一次错误识别单核苷酸而进行了正常基因的扩增时，则在此后的扩增反应中，也会与扩增突变基因同样地扩增正常基因， 因此，也被称作一种假阳性危险高的方法。当采用该方法时，需要严格控制反应条件(即， 反应温度、盐浓度等)，并且模板量也需要严格相同(例如，参照非专利文献5)，因此对检查非特定多数的标本的临床检查或者要求有高精度的基础上还要求简便性的诊断方法中并不适合采用。另一种检验体细胞的基因变异的方法，是在同时扩增突变基因和正常基因后通过区别突变基因和正常基因来进行检测的方法。作为通过区别所扩增的突变基因和正常基因进行检测的方法，有利用电泳的方法、利用杂交的各种方法等(例如，参照非专利文献 5)。但是，在大部分方法中，很难以良好的精度检测出包含在大量正常基因中的少量突变基因。例如，作为被称作突变基因检测的金标准(gold standard)的方法，有双脱氧测序法 (dideoxy sequencing) 0尽管双脱氧测序法能够以较高灵敏度检测突变基因，但当突变基因和正常基因混在时，突变基因的检测灵敏度为10%左右，无法达到高灵敏度的检测。除此之外，已有报道，在焦磷酸测序法中，可以提高检测灵敏度至5%左右，优于双脱氧测序法 (例如，参照非专利文献6)。另外，正在开发下述方法将含有突变的序列通过PCR进行扩增，求出其生成物的双链DNA的解链曲线，根据突变基因和正常基因的解链曲线的差别求出突变基因的比例。 在该方法中，可检测正常基因中所含的突变基因达到5%左右(例如，参照非专利文献7)。除此之外，还开发了利用具有相同碱基序列的双链之间链的重组反应(链置换反应)的PCR-PHFA法。PCR-PHFA法是若作为基因型的识别对象的试样(双链核酸)和已知序列的标准双链核酸之间的碱基序列完全相同，则不能对各链进行区别，并且发生链的重组(链置换(strand displacement))，但只要一个碱基有差别，则会在具有完全互补的碱基序列的链相互之间优先形成双链，因此，在试样与标准双链核酸之间不发生重组，而 PCR-PHFA法是利用该现象的突变检测法。已有报道通过使用该PCR-PHFA法，能够以左右的高灵敏度从实际标本中检测出突变基因(例如，参照非专利文献8)。如上所述，虽然 PCR-PHFA法是检测灵敏度高、再现性优良的方法，但在操作上稍有繁杂(例如，参照专利文献1)并且还有残留污染等问题。为了解决这些问题，提出了几种改良方法。例如，在专利文献2中，作为PCR-PHFA法的改良方法公开了利用荧光共振能量转移的方法。在以高灵敏度本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种识别基因型的方法，是识别基因突变中的基因型的方法，其特征在于，包括：核酸扩增工序，通过核酸扩增反应对具有试样中所含基因中的突变位点的区域进行扩增，获得含有试样双链核酸的扩增反应液；以及识别工序，通过将上述核酸扩增工序中所获得的扩增反应液与上述突变位点为特定基因型并且由标记物质所标记的标准双链核酸加以混合而进行竞争性链置换反应，并测定标准双链核酸与试样双链核酸之间发生链置换的程度，由此识别上述标准双链核酸与上述试样双链核酸的同一性，并且，上述竞争性链置换反应是在抑制了由聚合酶引起的延伸反应的条件下进行。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：山根明男，中山尚母，北野史朗，
申请(专利权)人：凸版印刷株式会社，
类型：发明
国别省市：JP