HCV基因型4复制子制造技术

提供了基因型4丙型肝炎病毒（HCV）的复制子。这些复制子包括产生HCV的体外复制能力的适应性变异。还提供了基因型4复制子的制备方法和利用这些复制子筛选抗病毒药剂的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】HCV基因型4复制子相关申请的相互引用根据美国法典第35篇第119 Ce)节，本申请要求享有2011年7月6日提交的美国临时申请序列号61/504，853、2011年7月20日提交的序列号61/509，984、以及2012年I月23日提交的序列号61/589，789的权益，其中的每一个的内容均通过引用以其整体并入本公开。
本公开涉及基因型4的丙型肝炎复制子(replicon)，以及制备和使用该复制子的方法。
技术介绍
慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染仍然是全世界约1.6亿感染者的巨大全球健康负担。目前的护理标准是聚乙二醇干扰素加利巴韦林(ribavirin)的24-48周疗程。由于此治疗方案的局部疗效及较差的耐药性，新的抗病毒药剂的开发和研制一直在紧张的进行中。最近，这些努力以FDA审核批准两种NS3蛋白酶抑制剂(波普瑞伟和特拉匹韦)与聚乙二醇干扰素和利巴韦林联合使用以用于治疗慢性基因型IHCV感染而告终。许多其它抑制剂正处于进一步临床开发中，然而，大多数还是被研制用于治疗基因型I感染。HCV是一种正链RNA病毒，显示极大的遗传多样性。已报道有6种主要基因型(SP基因型1-6)以及多种亚型(如基因型la、lb、lc等)。基因型1、2和3具有世界范围的分布。基因型Ia或Ib通常主要在北美、南美、欧洲和亚洲。然而，基因型2和3在这些地区也是常见的，并且可构成20-50%的感染。基因型4a主要在中东和许多非洲国家；高达15%的埃及人口感染有HCV，并且93%的感染是基因型4。基因型5在南非很普遍，而基因型6在亚洲更常见。尽管多数大陆 和国家具有一种“主要”基因型，但感染的人群几乎普遍是多种基因型的混合感染。此外，由于大规模移民和普遍的静脉用药，HCV感染的地理分布和多样性(流行病学)在不断演变。例如，基因型4a已明显传播到欧洲中部和北部。这就带来了临床挑战，因为对于直接抗病毒药物和包括当前护理标准的免疫调节疗法两者，各种基因型的响应不同，这是有据可查的。HCV复制子是来源于HCV基因组的自复制RNA序列，并且一直是作为分子病毒学研究和药物研发的主要工具(workhorse)。迄今为止，已由两种基因型和三种亚型(基因型la、lb和2a)建立了复制子。这些复制子在药物研发和改进的多个方面都是极其重要的，包括新型抑制剂类型的识别、临床候选药物的优化和临床耐药性的表征。最近，研发对所有主要HCV基因型有效的新一代药物的兴趣正在持续增长。理想的是，对“泛基因型(pan-genotypic)”药物和治疗方案的审批将极大地简化HCV的治疗。寻求泛基因型治疗方案的一个关键步骤将是研制使得能够研究所有主要基因型和亚型的体外工具。然而，来源于其它主要基因型(即除基因型la、Ib或2a以外的那些基因型)序列的复制子至今还未产生。尤其是，尽管基因型4HCV在中东、北非和欧洲的世界范围内流行，然而基因型4复制子至今未被描述。
技术实现思路
出乎意料地发现，通过将亚基因组基因型4cDNA转录和电穿孔至HCV允许细胞系(受纳细胞系，permissive cell line)可得到稳定复制基因型4复制子的克隆细胞系。与野生型病毒对比，已从这些克隆物中识别了适应性变异(adaptive mutation)。当通过定点诱变改造(engineer)这些变异并引入到细胞系中，随之而来的是HCV基因型4的复制。对于基因型4，这些适应性变异位于NS3 (T343K/R、A200E、或T511K)、NS4A (Q34K/R或E52V)、或NS5A (L179P)中。强健(稳健，robust)基因型4复制子体系的建立为促进药物开发和研制工作提供了有力工具。因此，本专利技术的一个实施方式提供了能够在真核细胞中复制的基因型4丙型肝炎病毒(HCV) RNA构建体，其中RNA序列包括5’ NTR,内部核糖体进入位点(IRES)，编码NS3、NS4A、NS4B、NS5A或NS5B中的一种或多种的序列，以及3’ NTR0一方面，构建体包括NS3、NS4A、NS4B、NS5A或NS5B中的一个或多个适应性变异。非限制性实例包括(1)在2204位上的异亮氨酸，(2)在NS3中的残基200上的谷氨酸、残基343上的赖氨酸或精氨酸、残基511上的精氨酸、或它们的组合，(3)在NS4A中的残基34上的赖氨酸或精氨酸、残基52上的缬氨酸、或它们的组合，或者(4)在NS5A中的残基179上的脯氨酸。还设想了构建体包括至少2个、或者可替换的3个或4个适应性变异。一方面，适应性变异来自不同的基因。在一些方面，构建体是亚基因组或全长HCV复制子。此外，还提供了转录为RNA构建体的DNA、包括RNA构建体的病毒颗粒、以及含有这种DNA或RNA的细胞。在一个实施方式中，还提供了包括一个或多个相应适应性变异的单独的NS3、NS4A、或NS5A蛋白。还提供了编码这些蛋白的多核苷酸和特异性识别这些蛋白的抗体。在本专利技术的另一个实施方式中，提供了一种包括基因型4丙型肝炎病毒(HCV)RNA的分离细胞，其中基因型4丙型肝炎病毒(HCV) RNA是在细胞中复制的。一方面，在细胞中不存在编码RNA的DNA构建体。另一方面，细胞包括至少10个拷贝的RNA，或者可替换地至少约 100、500、1000、2000、5000、10，OOOUxlO5, IxlO6、IxlO7, IxlO8 或 IxlO9个拷贝的 RNA。在这些方面中的任一个中，RNA可以是亚基因组HCV序列或全长HCV序列，并且可以包括如上所述的一个或多个适应性变异。一方面，细胞是哺乳动物细胞，其可以是，例如，肝瘤细胞，特别是Huh71C细胞。还提供了提高基因型4HCV病毒RNA在真核细胞中的复制能力的方法，包括以下各项中的一个或多个:(a)用谷氨酸取代NS3的残基200，(b)用赖氨酸或精氨酸取代NS3的残基343，(c)用精氨酸取代NS3的残基511，(d)用赖氨酸或精氨酸取代NS4A的残基34，Ce)用缬氨酸取代NS4A的残基52，或者(f)用脯氨酸取代NS5A的残基179。在一个实施方式中，还提供了一种识别抑制基因型4HCV的复制或活性的药剂的方法，包括将任何以上实施方式中的细胞与候选药剂接触，其中，由RNA编码的蛋白质的复制减少或活性降低表明该药剂抑制HCV的复制或活性。可替换地，该方法包括将以上实施方式的任一个中的细胞裂解液与候选药剂接触，其中，由RNA编码的蛋白质的活性降低表明该药剂抑制HCV的活性。【附图说明】与附图一起阅读以下详细描述，可以对本专利技术有最好的理解。附图包括以下各图:图1是基因型4a复制子构建体的示意图。HCV复制子用于生成新型基因型4a稳定复制子细胞系。ED434a菌株复制子编码新霉素磷酸转移酶II (A)或海肾荧光素酶(Rluc)-新霉素磷酸转移酶II融合报告子(B)。合成的复制子并入以下要素，从5’至3’:ED435’UTR;新霉素磷酸转移酶II基因(neo)或Rluc-Neo基因；脑心肌炎病毒(EMCV)IRES ；包括NS5A适应性变异(S2204I)的ED43的NS3-NS5B多聚蛋白区；以及ED43的3’UTR。实心黑方框表示HCV核心序列。圆点阴影方框表示HCV多聚蛋白序列。“ + ”本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能够在真核细胞中复制的基因型4丙型肝炎病毒（HCV）RNA构建体，其中，所述RNA的序列包括5'NTR，内部核糖体进入位点（IRES），编码NS3、NS4A、NS4B、NS5A、或NS5B中的一种或多种的序列，以及3'NTR。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.07.06 US 61/504,853;2011.07.20 US 61/509,984;1.一种能够在真核细胞中复制的基因型4丙型肝炎病毒(HCV)RNA构建体，其中，所述RNA的序列包括5’NTR，内部核糖体进入位点(IRES)，编码NS3、NS4A、NS4B、NS5A、或NS5B中的一种或多种的序列，以及3’ NTR02.根据权利要求1所述的RNA构建体，其中，与野生型相比，所述构建体包括在NS3、NS4A、NS4B、NS5A、*NS5B中的适应性变异。3.根据权利要求2所述的RNA构建体，其中，所述变异包括在2204位上的异亮氨酸。4.根据前述权利要求中任一项所述的RNA构建体，其中，所述变异包括在NS3中的残基200上的谷氨酸、残基343上的赖氨酸或精氨酸、残基511上的精氨酸、或它们的组合。5.根据前述权利要求中任一项所述的RNA构建体，其中，所述变异包括在NS4A中的残基34上的赖氨酸或精氨酸、残基52上的缬氨酸、或它们的组合。6.根据前述权利要求中任一项所述的RNA构建体，其中，所述变异包括在NS5A中的残基179上的脯氨酸。7.根据前述权利要求中任一项所述的RNA构建体，其中，所述构建体包括至少一个在NS3中的适应性变异和至少一个在NS4A中的适应性变异。8.根据前述权利要求中任一项所述的RNA构建体，其中，所述构建体包括至少一个在NS3中的适应性变异和至少一个在NS5A中的适应性变异。9.根据前述权利要求中任一项所述的RNA构建体，其中，所述构建体包括至少一个在NS4A中的适应性变异和至少一个在NS5A中的适应性变异。10.根据前述权利要求`中任一项所述的RNA构建体，其中，所述构建体包括至少一个在NS3中的适应性变异、至少一个在NS4A中的适应性变异、和至少一个在NS5A中的适应性变巳11.根据前述权利要求中任一项所述的RNA构建体，其中，所述基因型4HCV是基因型4a HCV。12.根据前述权利要求中任一项所述的RNA构建体，还包括用于选择的标记基因。13.根据权利要求12所述的RNA构建体，其中，所述标记基因是新霉素磷酸转移酶基因。14.根据前述权利要求中任一项所述的RNA构建体，还包括报告基因。15.根据权利要求14所述的RNA构建体，其中，所述报告基因是荧光素酶。16.根据前述权利要求中任一项所述的RNA构建体，其中，所述构建体包括，从5’到3’:所述 5’ NTR,所述 IRES,编码 NS3、NS4A、NS4B、NS5A、和 NS5B 的序列，以及所述 3’ NTR。17.根据前述权利要求中任一项所述的RNA构建体，还包括编码C、E1、或E2中的一种或多种的序列。18.一种单链或双链DNA，可以转录为前述权利要求中任一项所述的RNA构建体。19.一种病毒颗粒，包含权利要求1至17中任一项所述的RNA构建体。20.一种分离细胞，包含权利要求1至17中任一项所述的RNA构建体或权利要求18所述的DNA。21.—种HCV基因型4的NS3蛋白，包括残基200上的谷氨酸、残基343上的赖氨酸或精氨酸、残基511上的精氨酸、或它们的组合。22.—种HCV基因型4的NS4A蛋白，包括残基34上的赖氨酸或精氨酸、残基52上的缬氨酸、或它们的组合。23.—种HCV基因型4的NS5A蛋白，包括残基179上的脯氨酸。24.—种HCV基因型4的NS5A蛋白，包括残基179上...

【专利技术属性】
技术研发人员：威廉四世·E·德拉尼，程国锋，莫红梅，徐思民，彭倍儿，
申请(专利权)人：吉利德科学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US