本发明专利技术涉及一种鉴别水稻垩白基因Chalk5等位基因型的分子标记，根据能显著降低稻米垩白从而提高稻米外观品质的主效基因Chalk5的显隐性等位基因的功能突变位点开发两对特异PCR引物分子标记Chalk12、NChalk12和Chalk22、NChalk22。本发明专利技术另涉及一种鉴别水稻垩白基因Chalk5等位基因型的方法，以前述分子标记对不同水稻植株DNA进行扩增。本发明专利技术不仅能准确鉴定水稻是否含有水稻Chalk5垩白基因，亦能进一步区分Chalk5基因的纯合体和杂合体，提高对水稻粒重的选择效率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术工程领域，特別涉及一种鉴别水稻垩白基因Chalk5等位基因型的分子标记及其方法，属于生物技术工程领域，以用于Chalk5等位基因型水稻种质资源鉴定以及品种选育。
技术介绍
水稻是我国的主要的粮食作物，种植面积和总产在我国都位居第一。中国在杂交育种、花培育种、杂种优势利用等方面居世界领先水平。随着人们生活水平的提高，消费者对稻米品质需求越来越高。稻米品质由加工品质、外观品质、蒸煮食味品质和营养品质组成，具体内容有：透明度、垩白、粒型、直链淀粉含量、胶稠度、糊化温度、蛋白质含量以及有无香味等等。其中的外观品质尤为重要，是水稻商品性的直接体现，决定了其在市场竞争中的地位。垩白是衡量水稻外观品质优劣的重要指标之一，降低稻米的垩白是培育优质水稻品种的前提。稻米垩白是指胚乳充实不足，胚乳中的淀粉和蛋白颗粒排列疏松，颗粒之间存在空气，阳光照射透过其内部而致使光线发生折射形成的一种光学特性。根据其发生部位的不同可分为背白、腹白和心白。由于水稻种子灌浆的顺序是从背部到腹部、从周边到中心，因此水稻垩白中腹白最多，背白最少。相关研究表明，垩白与其他品质性状存在一定的相关性。在外观品质中，李欣等认为垩白与粒形的相关性因籼、粳稻而异，籼稻米粒垩白与粒宽呈极显著正相关，与长宽比呈极显著负相关，而粳稻米粒垩白面积与粒型、粒长没有明显相关性。在加工品质上面，徐富贤等认为垩白与整精米率呈显著负相关。在籼稻的蒸煮食味品质中，周少川等认为垩白与直链淀粉含量和糊化温度呈极显著正相关，与胶稠度呈极显著负相关，而在粳稻中，这些相关性不显著。这一结论与刘奇华等的研究结果一致。垩白是典型的数量性状，受多基因调控，以加性效应为主，同时也容易受到环境的影响，如温度、肥力水平等。因此，对垩白性状的遗传研究比较困难。不同的研究者利用不同的遗传群体对垩白性状进行了大量的研究，鉴定了部分相关数量性状基因座(quantitative trait loci，QTL)。到目前为止共定位到85个与垩白相关的QTL，其中与垩白大小有关的QTL为13个，与垩白度相关的有21个，控制垩白率的有51个，但多数研究尚停留在QTL初步和精细定位的层面上。目前已克隆的与垩白相关的基因共8个，其中6个是通过转移DNA(transfer-DNA,T-DNA)插入、辐射诱变、化学诱变等方式创制人工突变体而分离克隆的，2个是利用自然突
变的材料克隆的，前者的优点是能创造极端表型，等位基因效应大，较易分离克隆，但是限制了其在育种实践中的直接应用。GW2是第一个利用自然变异克隆的垩白相关基因，位于第2染色体上，编码一个E3泛素连接酶，它使籽粒变宽和粒重增加的同时籽粒的垩白也增加，可能是由于粒宽增大，籽粒灌浆速度加快，从而导致垩白的产生。Chalk5是最近克隆的一个控制水稻垩白的主效QTL，该基因编码一种液泡上的无机焦磷酸水解作用和氫離子H+转运作用的焦磷酸转移酶。Chalk5的过量表达使胚乳的垩白增加，推测是由于干扰了种子发育过程中膜运输系统的pH稳态，进而影响蛋白体的生物合成，使小囊泡结构大量增加，因此在胚乳的贮藏部位形成空气泡即垩白。与低垩白品种H94等位基因序列比较，高垩白品种珍汕97(Zhenshan97)等位基因序列发生39处多态性变异，其中10处变异发生在翻译起始位点上游1.8kb的启动子上，这些变异包括替换、插入和缺失三种突变类型。5处变异发生在外显子上，但仅在第一个和第四个外显子上发生两个氨基酸替换，内含子上有24处单核苷酸多型性(single-nucleotide polymorphism,SNP)变异。对该基因进行功能性遗传变异分析发现，在珍汕97启动子-721位点和-485位点的两个SNPs变异导致其与种子发育相关的两个顺式调控原件(负方向)在H94启动子中发生了变异，位于-721位点的是负责种子特异表达和脱落酸(abscisic acid,ABA)相应的RY/G-box(CATGCA)，位于-485位点的是负责种子发育过程中光合产物运输和代谢的CACT-box。研究结果表明，这两个突变位点上具有与珍汕97相同等位基因型的，Chalk5的RNA表达量较高，与同一时期的珍汕97表达量相近，任意一个位点发生突变，Chalk5的RNA表达量降低，与同一时期H94的RNA表达量相近。垩白是典型的数量性状，容易受到环境的影响，且其表型是在成熟收获后才能进行选择。有鉴于此，如何发展出获得Chalk5的功能标记能快捷、准确鉴定不同基因型，现有技术实有待改善的必要。
技术实现思路
本专利技术针对水稻垩白率在稻米外观品质改良选育过程中，呈连续分布且易受气候等环境条件影响造成鉴定不准确的技术难题。根据高垩白率和低垩白率在Chalk5位点存在的功能性单碱基突变，设计、合成目的基因的功能标记，并通过简单的检测方法，快速鉴定含低垩白率Chalk5等位基因型的水稻种质资源，同时还能进一步应用于分子标记辅助育种。因此，在Chalk5基因克隆的基础上，每个位点分别开发了三对等位基因特异PCR[Allele-specific polymerase chain reaction(AS-PCR)又或稱扩增受阻突变体系聚合酶链反应(amplification refractory mutation system polymerase chain reaction，ARMS-PCR)]引物。经过梯度PCR筛选，每个位点均得到一对能高效特异扩增的引物,其中分子标记Chalk12、NChalk12和Chalk22、NChalk22，能够快捷、准确鉴定Chalk5基因的不同基因型，将有利于水稻外观品质改良的分
子育种。本专利技术的目的是提供一种鉴别水稻垩白基因Chalk5等位基因型的分子标记，其特征在于：所述等位基因型包括垩白基因Chalk5启动子-714位点与-485位点；所述垩白基因Chalk5启动子-714位点的分子标记是由一对引物SEQ ID NO：1与由SEQ ID NO：2、3、4、5、6及7所构成的群组中选出的一种所组成；以及所述垩白基因Chalk5启动子-485位点的分子标记是由一对引物SEQ ID NO：14与由SEQ ID NO：8、9、10、11、12及13所构成的群组中选出的一种所组成。优选的，所述垩白基因Chalk5启动子-714位点的分子标记是由一对引物SEQ ID NO：1与由SEQ ID NO：3、及6所构成的群组中选出的一种所组成；以及所述垩白基因Chalk5启动子-485位点的分子标记是由一对引物SEQ ID NO：14与由SEQ ID NO：9及12所构成的群组中选出的一种所组成。本专利技术另提供一种鉴别水稻垩白基因Chalk5等位基因型的方法，其特征在于，所述方法包含下列步骤：提取一水稻样品的脱氧核醣核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)；以所述水稻样品的脱氧核醣核酸为模板，利用权利要求1所述分子标记进行聚合酶链锁反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增，得到一产物；以及分析聚合酶链锁反应扩增后的产物，进行结果判定，所述结果判定为：如果分子标记由一对引物SEQ ID NO：1与由SEQ ID本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鉴别水稻垩白基因Chalk5等位基因型的分子标记，其特征在于，所述等位基因型包括垩白基因Chalk5启动子‑714位点与‑485位点；所述垩白基因Chalk5启动子‑714位点的分子标记是由一对引物SEQ ID NO：1与由SEQ ID NO：2、3、4、5、6及7所构成的群组中选出的一种所组成；以及所述垩白基因Chalk5启动子‑485位点的分子标记是由一对引物SEQ ID NO：14与由SEQ ID NO：8、9、10、11、12及13所构成的群组中选出的一种所组成。
【技术特征摘要】
1.一种鉴别水稻垩白基因Chalk5等位基因型的分子标记，其特征在于，所述等位基因型包括垩白基因Chalk5启动子-714位点与-485位点；所述垩白基因Chalk5启动子-714位点的分子标记是由一对引物SEQ ID NO：1与由SEQ ID NO：2、3、4、5、6及7所构成的群组中选出的一种所组成；以及所述垩白基因Chalk5启动子-485位点的分子标记是由一对引物SEQ ID NO：14与由SEQ ID NO：8、9、10、11、12及13所构成的群组中选出的一种所组成。2.根据权利要求1所述鉴别水稻垩白基因Chalk5等位基因型的分子标记，其特征在于，所述垩白基因Chalk5启动子-714位点的分子标记是由一对引物SEQ ID NO：1与由SEQ ID NO：3、及6所构成的群组中选出的一种所组成；以及所述垩白基因Chalk5启动子-485位点的分子标记是由一对引物SEQ ID NO：14与由SEQ ID NO：9及12所构成的群组中选出的一种所组成。3.一种鉴别水稻垩白基因Chalk5等位基因型的方法，其特征在于，所述方法包含下列步骤：提取一水稻样品的脱氧核醣核酸；以所述水稻样品的脱氧核醣核酸为模板，利用权利要求1所述分子标记进行聚合酶链锁反应扩增，得到一产物；以及分析聚合酶链锁反应扩增后的产物，进行结果判定。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述水稻样品包含南京1号、南京11号、南京14号、南京15号...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱金燕，杨杰，王军，李文奇，范方军，王芳权，仲维功，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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