一种筛选抗HSV-1药物的试剂盒和方法技术

本发明专利技术提供了一种用于筛选抗单纯疱疹病毒I型药物的试剂盒，其包含了单纯疱疹病毒I型碱性核酸酶、碱性缓冲液、MgCl2和核酸。还提供了一种用于筛选抗单纯疱疹病毒I型药物的方法，步骤为：在所述试剂盒中加入待测药物，反应5～60分钟后，检测核酸降解程度。本发明专利技术提供的筛选抗单纯疱疹病毒I型药物的方法克服了传统筛药方法复杂、成本高等缺点，实现了快速、简便、低成本筛药。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及药物筛选领域，具体涉及一种筛选抗HSV-I药物的试剂盒和方法。
技术介绍
单纯疱疹病毒I型(HSV-I)为有包膜的DNA病毒，是危害人类健康的常见病原体， 且容易导致复发性感染和潜伏感染。HSV-I感染部位广泛，能引起口唇疱疹、生殖器疱疹、脑炎、角膜炎等，并与宫颈癌和唇癌有关。HSV-I具有神经毒性，可侵犯中枢神经系统、破坏神经细胞。目前，治疗由HSV-I引起的上述疾病的有效药物主要为阿昔洛韦(ACV)，其吸收差， 且根据国家药品不良反应监测中心病例报告显示，其引起的急性肾功能损害和血尿问题突出。因此，筛选更多抑制该病毒的药物非常必要。现有技术中公知的主要筛药体系仍为传统的动物模型筛药体系和细胞模型筛药体系，存在实验周期较长，实验步骤较复杂等缺点，难以迅速将潜在药物筛选出来，不能满足药物研发初期高通量快速筛选药物的要求。碱性核酸酶是由HSV-I基因组中UL12基因编码的，已经被报道有5’ 3’的核酸外切酶和核酸内切酶活性，因其反应的最适PH值较高，所以被认为是碱性核酸酶。在HSV-I 的复制中起着重要的作用，有研究证实碱性核酸酶能正确修复DNA复制过程中的断裂和缺口，并能使处于复制状态的病毒基因组易于包装。该编码基因被敲除后HSV-I突变体复制几乎停止，说明碱性核酸酶为病毒体内繁殖所必须。还有实验证明，在非容纳细胞中产生的 UL12基因组缺陷病毒，由于有异常基因组而很难感染新的细胞。上述研究证明碱性核酸酶在病毒的复制及其感染过程中是非常关键的，这为碱性核酸酶成为一种新的抗疱疹病毒药物筛选靶点提供了证据。也就是说，能够抑制碱性核酸酶活性的物质也具有抑制HSV-I的作用，进而推测这些物质具有治疗由HSV-I引起的各种疾病的作用。因此，筛选治疗这些疾病的潜在药物可以通过检测其能否抑制碱性核酸酶活性来实现。然而，UL12基因片段长，GC含量高，难以通过常规的PCR方法方便、准确地获得全序列的UL12基因片段，进而获得大量有活性的碱性核酸酶，目前也未见市售品出现，因此以碱性核酸酶作为筛药体系关键成分制备快速筛药系统难以适应临床大量应用的需要。
技术实现思路
为了克服现有技术存在的缺点，本专利技术提供了一种方便快捷地筛选大量抗HSV-I 药物的方法。因此，本专利技术目的之一是提供一种用于筛选抗HSV-I药物的试剂盒，包含HSV-I碱性核酸酶、碱性缓冲液、MgCl2和核酸。上述试剂盒内各成分浓度优选如下HSV-1碱性核酸酶浓度为0. 5 0. 7mg/ml、碱性缓冲液浓度为40 60mM、MgCl2浓度为2 4mM、核酸浓度为1. 4 1. 6 μ g/ml。上述试剂盒内各成分浓度进一步优选如下HSV-1碱性核酸酶浓度为0. 64mg/ml,碱性缓冲液浓度为50mM、MgCl2浓度为3mM和核酸浓度为1. 516 μ g/ml。为了克服现有技术难以方便获得大量有活性的碱性核酸酶的缺陷，本专利技术试剂盒中HSV-I碱性核酸酶是用如下方法得到的其步骤如下(1)扩增目的基因提取HSV-I病毒基因组作为模板，以SEQ ID NO :1 2所示的核苷酸序列作为引物扩增HSV-I的UL12基因片段，扩增程序为96°C预变性;3min，95°C 变性40s，68°C 72°C退火延伸anin30s，31个循环，72°C延伸IOmin ；胶回收并纯化扩增的 UL12基因片段；(2)构建重组质粒用内切酶将步骤⑴获得的UL12基因片段与表达质粒连接， 获得重组质粒；(3)诱导表达将步骤( 获得的重组质粒转化至大肠杆菌，涂布在含有适当抗生素的平板上；培养重组质粒的大肠杆菌转化子使其生长至对数期；加入异丙基2b-D2硫代半乳糖苷酶(IPTG)诱导表达；离心收集菌体；(4)变性a，用含有变性剂的洗涤液两次洗涤步骤(3)得到的菌体；b，冷冻超声破碎细胞，离心收集沉淀；c，用含有不同变性剂的多种洗涤液分别洗涤沉淀，离心，收集沉淀； d，用含有高浓度变性剂的洗涤液超声洗涤沉淀，得到蛋白溶液；(5)复性用盐酸胍浓度逐步减小的复性液复性步骤(4)得到的蛋白溶液，获得活性蛋白。上述HSV-I碱性核酸酶的方法步骤(1)还优选包括如下步骤将T载体与得到的 UL12基因片段连接形成重组T载体，以该重组T载体为模板，以SEQ ID NO :1 2所示的核苷酸序列作为引物扩增得到核苷酸序列如SEQID NO 3所示的HSV-I的UL12基因片段， 扩增程序为96°C预变性3min，95°C变性40s, 6872°C退火延伸2min 30s，31个循环， 72°C延伸IOmin ；胶回收并纯化扩增的UL12基因片段。本方法中退火、变性温度均优选为 68 "C。上述得到HSV-I碱性核酸酶的方法步骤O)中表达质粒为PET系列质粒，优选为 pET32a-UL12 或者 pEI^8a_UL12 质粒。上述得到HSV-I碱性核酸酶的方法步骤(3)中大肠杆菌为E. coli BL12菌株或者为 E. coli Rosetta 菌株。上述得到HSV-I碱性核酸酶的方法中步骤⑷采用的变性方法为用洗涤液A两次洗涤步骤C3)获得的菌体；冷冻超声破碎菌体，离心收集沉淀；用洗涤液B、C、D依次洗涤、离心、收集沉淀；用洗涤液E溶解沉淀，获得蛋白溶液；所述的洗涤液A 包含 50mM Tris-HCl 、2mM EDTA, IOOmM NaCl 的溶液；洗涤液 B:包含 50mM Tris-HCl 、2mM EDTAUOOmM NaCl、1 % NP-40 (乳化剂 NP40 系列) 的溶液；洗涤液 C :包含 50mM Tris-HCl 、2mM EDTAUOOmM NaCl、3% TritonX-100、 ImM苯甲基磺酰氟的溶液；洗涤液D :包含50mM Tris-HCl 、2mM EDTA, IOOmM NaCl.O. 5% TritonX-lOOU. 5M盐酸胍、ImM苯甲基磺酰氟的溶液；洗涤液E 包含IOOmM Tris-HCl ,2mM EDTAUOOmM NaClUOmM β -巯基乙醇、ImM 苯甲基磺酰氟和 4 6M 盐酸胍的溶液。洗涤液E中盐酸胍浓度优选为4Μ。上述得到HSV-I碱性核酸酶的方法步骤( 中的复性液为包含 50mMTr i s-HCl ,2mM EDTA、50mM NaCl、5 %甘油、1 %甘氨酸和盐酸胍浓度递减的溶液，盐酸胍浓度依次为4M、3M、2M、IM和0M。本专利技术试剂盒中碱性缓冲液为Tris-HCl缓冲液，核酸为环状DNA或者线性DNA， 环状DNA可以是pcDNA3. 0质粒，线性DNA可以是单纯疱疹病毒I型碱性核酸酶基因片段 UL12。本专利技术试剂盒中碱性缓冲液的pH值优选为8. 5 9. 5，进一步优选为9. 0。本专利技术另一个目的是提供一种用上述试剂盒筛选抗HSV-I药物的方法，往上述试剂盒中加入待测药物，反应5 60分钟后，检测所述试剂盒内的核酸降解程度。上述待测药物浓度优选为150 1200μ g/ml。本专利技术的有益效果克服传统筛药体系的缺点，操作简单，成本低，可用于快速高通量筛选抗HSV-I的潜在药物。附图说明图1实施例1步骤(1)扩增UL12基因片段的琼脂糖凝胶电泳图。泳道M :DNA Marker DL2000 ；泳道本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种用于筛选抗单纯疱疹病毒Ｉ型药物的试剂盒，其特征在于：包含独立包装的单纯疱疹病毒Ｉ型碱性核酸酶、碱性缓冲液、ＭｇＣｌ２和核酸。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：陈恬，曾南，陈洪宇，李学东，何婷，
申请(专利权)人：成都医学院，
类型：发明
国别省市：90