布鲁氏菌病CF-ELISA抗体检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种布鲁氏菌病补体结合酶联免疫吸附试验(CF‑ELISA)诊断试剂盒，本试剂盒将补体结合试验(CFT)中的反应系统与酶联免疫吸附试验(ELISA)中的酶标记放大系统相结合。本试剂盒较传统补体结合试验诊断试剂而言，具有敏感性高、使用简便、快速、高通量，标准化程度高的特点，而较传统ELISA诊断试剂盒而言，具有特异性高、可检测各种布病特异性抗体的特点，是一种较为理想的新型布病诊断工具。本试剂盒主要组份：脂多糖LPS抗原包被板、强阳性对照血清、弱阳性对照血清、阴性对照血清、豚鼠补体、酶标记豚鼠补体C1q‑B单克隆抗体60G4、底物显色液、终止液、洗涤液。

CF ELISA brucellosis antibody detection kit

The invention relates to a complement of brucellosis with enzyme-linked immunosorbent assay (CF ELISA) diagnostic kit, the kit will complement fixation test (CFT) in the reaction system and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) enzyme marker amplification in combined system. This kit is the traditional complement fixation test diagnostic reagents, has high sensitivity, easy to use, fast and high throughput characteristics, high degree of standardization, rather than the traditional ELISA diagnostic kit, has the characteristics of high specificity and can detect a variety of brucellosis antibodies, is a new type of brucellosis diagnostic tool ideal the. The kit of main components: lipopolysaccharide LPS antigen coated plate, positive control serum, weak positive serum and negative control serum and guinea pig complement, enzyme labeled guinea pig complement C1q B monoclonal antibody 60G4, chromogenic substrate solution and stop solution, washing liquid.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及检测用生物制品领域，具体是涉及布鲁氏菌病补体结合试-酶联免疫吸附试验(CF-ELISA)抗体检测试剂盒，是一种新型布鲁氏菌病诊断制品。
技术介绍
布鲁氏菌病(布病Brucellosis)是由布鲁氏菌或称布鲁氏菌(Brucella)引起的以流产和发热为特征的人兽共患传染病。布病在世界存在已有久远的历史，人类对该病的研究认识逐步加深，诊断水平不断提高，随着布病诊断技术不断发展，布病血清学的检测方法不断改进和提高。平板凝集试验(PT)、试管凝集试验(SAT)等传统的诊断技术，逐渐被敏感性高、特异性强的虎红平板凝集试验(RBPT)、补体结合试验(CFT)、间接酶联免疫吸附试验(iELISA)、竞争酶联免疫吸附试验(cELISA)、荧光偏振试验(FPA)等新检测技术所取代。当前，国际贸易指定的牛、羊、猪布病血清学检测方法有RBPT、CFT、iELISA、cELISA、FPA。在布病血清学检测技术中，CFT被一致认为在特异性上优于其他方法，常被用来对虎红平板凝集试验等初筛试验检测为阳性或可疑的样品进行确诊。有研究报道称，补体结合试验的高特异性处决于其抗原抗体反应具有高特异性时，才能使得反应抗体暴露补体结合位点，引发补体结合，而凝集类试验、ELISA等在抗原抗体结合位点部分类似情况下，也可能出现结合而导致假阳性的发生。但传统布病补体结合试验中，需使用新鲜采集的绵羊红细胞，补体需在检测当天进行严格定量，因而，绵羊红细胞与补体等试剂的定量准确性对结果影响很大，而这些试剂的需在检测现场定量，对试剂的标准化产生很大影响。再加上敏感性不太高，操作繁琐，难以在临床上普遍使用。ELISA是一种操作方便，灵敏度高，特异性也较好的布病诊断技术，并且具有高通量检测的特点。目前，用于布病检测有间接ELISA(iELISA)和竞争ELISA(cELISA)两种ELISA技术。其中iELISA可以作为动物群体检测的筛选试验使用，cELISA可以作为动物个体检测的确诊试验使用。牛的布病ELISA检测方法已是国际贸易中指定的检测方法之一，其他种动物布病的ELISA检测方法也是研究的热点。但ELISA检测方法中，使用的酶标记二抗只检测IgG类布病抗体，对IgM等类型的布病抗体存在漏检。CF-ELISA是一种在ELISA板孔中以酶显色技术显示抗原抗体特异性反应结果的补体结合类试验，CF-ELISA即具有CFT的高特异性优点，又具有ELISA高敏感性的优点，与传统补体结合试验相比，灵敏度高，操作方便，具有高通量检测的特点。本专利技术采用补体结合试验原理，结合以酶标记放大技术，提供了一种新型的布鲁氏菌病抗体检测试剂盒。本专利技术用纯化的布鲁氏菌LPS作为ELISA板的包被抗原，用以捕捉血清中布鲁氏菌病抗体，再通过加入豚鼠补体构成一种抗原、抗体与补体3者相互反应结合的补体结合反应系统，通过HRP标记的豚鼠补体C1q-B60G4单抗及酶显色底物等作为补体结合反应的指示系统，建立了一种基于补体结合类反应的布鲁氏菌病抗体检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供用于一种新型的基于补体结合试验原理的布鲁氏菌病抗体检测试剂盒。本专利技术试剂盒包含布脂多糖LPS抗原包被板、豚鼠补体、酶标记的豚鼠补体C1q-B单克隆抗体60G4，所述豚鼠补体C1q-B单克隆抗体60G4是由豚鼠补体C1q-b单抗60G4细胞株制备的，所述60G4细胞株已于2015年9月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCN0.11186。所述抗原包被板的抗原是由布鲁氏菌S2菌株提取纯化的脂多糖LPS，所述布鲁氏菌S2菌株于2015年9月8日保藏中国兽医微生物菌种保藏中心，保藏编号为CVCC70512。所述酶标记的补体C1q-B单克隆抗体60G4中的酶为辣根过氧化物酶HRP。所述试剂盒还包括强阳性对照血清、弱阳性对照血清、阴性对照血清、底物显色液、终止液、洗涤液。所述底物显色液为双组份TMB，所述终止液为稀硫酸，所述洗涤液为20倍浓缩的PBS-Tween洗涤液。所述豚鼠补体C1q-B单克隆抗体60G4的腹水效价≥1:200，OD450nm值≥2.00。所述补体效价为1:16倍稀释，OD450nm值≥1.00。所述强阳性对照血清浓度为50IU/ml，所述弱阳性对照血清浓度为25IU/ml。所述抗原包被板的包被方法为：布鲁氏菌S2株LPS抗原用0.05mo1/L碳酸盐缓冲液稀释，加入到酶标板，每孔100μl，2～8℃包被18小时以上，弃去孔中的抗原包被液，加入0.01mo1/L磷酸盐-吐温缓冲液洗涤酶标板4次。弃去洗涤液，用3％BSA或其它ELISA用封闭剂200μL/孔在2～8℃封闭18小时以上。用0.01mo1/L磷酸盐-吐温缓冲液洗板4次，弃去洗涤液后37℃干燥2h，加干燥剂一起放入锡箔袋中，抽真空密封；本专利技术公开了该试剂盒使用方法：在抗原包被板上加入被检测的动物血清样品和对照血清，再加入豚鼠补体进行补体结合反应，然后加入酶标记的豚鼠补体C1q-B单克隆抗体，再加入底物显色液进行显色，加入终止液后测定OD值。本专利技术的优点1、本专利技术采用补体结合试验原理，结合以酶标记放大技术，建立了一种新型的布鲁氏菌病抗体检测技术试剂盒，使得本专利技术既具有补体结合试验的高特异性，又具有ELISA技术的高敏感性。较之传统布病补体结合试验诊断试剂盒而言，除保留了高特异性的特点外，大大提高了检测敏感性，并且使用更简便、可实现高通量检测、试剂易于标准化。较布病ELISA诊断试剂盒而言，除保留了高敏感性的特点外，还可检测IgG、IgM等各种类型的布病特异性抗体，提高了检测特异性及敏感性。因此，布病CF-ELISA诊断试剂盒是一种较为理想的新型布病诊断工具，是目前动物布病检测中特异性和敏感性均较为理想的检测试剂盒。对提高布病检测技术水平具有重要作用。2、本专利技术的布病CF-ELISA诊断试剂盒可检测所有类型的布病抗体。本专利技术采用我国独有的、对猪、牛、羊均具有良好的抗原性猪种布鲁氏菌S2株提取脂多糖(LPS)作为包被抗原，使得该试剂盒能同时对猪、牛、羊布病进行高通量检测，相对于现有技术抗原采用牛种布鲁氏菌A99株只能对应检测一种动物而言，使用更方便，也更适合我国布病防控的实际需求。3、本试剂盒所用的补体为豚鼠血清，该试剂已商品化，但与传统补体结合试验中补体使用不同的是，在本试剂盒中的补体只需过量使用即可，降低了进行定量标化的难度，有利于试剂盒的标准化。具体实施方式本专利技术中用于ELISA板的包被抗原，是从本单位研究培育的布鲁氏菌S2菌株提取纯化的脂多糖(LPS)，该菌株于2015年9月8日保藏中国兽医微生物菌种保藏中心，保藏编号为CVCC70512。本专利技术中用于指示系统的豚鼠补体C1q-B60G4单抗，是本单位研制的一种对豚鼠补体C1q-B具有良好亲和性的单克隆抗体，由豚鼠补体C1q-B单抗60G4细胞株制备，该细胞株已于2015年9月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCN0.11186。本专利技术研制了布鲁氏菌病CF-ELISA抗体检测试剂盒质控用强阳性标准血清、弱阳性标准血清、阴性标准血清、强阳性对照血清、弱阳性对照血清、阴性对照血清。本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种布鲁氏菌病抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含布脂多糖LPS抗原包被板、豚鼠补体、酶标记的豚鼠补体C1q‑B单克隆抗体60G4，所述豚鼠补体C1q‑B单克隆抗体60G4是由豚鼠补体C1q‑b单抗60G4细胞株制备的，所述60G4细胞株已于2015年9月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.11186。

【技术特征摘要】
1.一种布鲁氏菌病抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含布脂多糖LPS抗原包被板、豚鼠补体、酶标记的豚鼠补体C1q-B单克隆抗体60G4，所述豚鼠补体C1q-B单克隆抗体60G4是由豚鼠补体C1q-b单抗60G4细胞株制备的，所述60G4细胞株已于2015年9月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCN0.11186。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗原包被板的抗原是由布鲁氏菌S2菌株提取纯化的脂多糖LPS，所述布鲁氏菌S2菌株于2015年9月8日保藏中国兽医微生物菌种保藏中心，保藏编号为CVCC70512。3.根据权利要求1-2任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标记的补体C1q-B单克隆抗体60G4中的酶为辣根过氧化物酶HRP。4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括强阳性对照血清、弱阳性对照血清、阴性对照血清、底物显色液、终止液、洗涤液。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述底物显色液为双组份TMB，所述终止液为稀硫酸，所述洗涤液为20倍浓缩的PBS-Tween洗涤液。6.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述豚鼠补体C1...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛开荣，张金亚，王楠，徐磊，王苗苗，丁家波，蒋玉文，朱良全，程君生，蒋卉，蒋菲，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：北京;11