【技术实现步骤摘要】
本申请涉及生物医药，具体涉及一种山羊肾悬浮细胞培养牛结节性皮肤病灭活疫苗病毒（山羊痘病毒，av41株）抗原的方法。
技术介绍
1、牛结节性皮肤病(lumpy skin disease，lsd)，又称牛结节疹、牛结节性皮炎或牛疙瘩皮肤病，是由痘病毒科、山羊痘病毒属牛结节性皮肤病病毒(lsdv)引起的一种牛全身性感染疫病，特征为发热、皮肤(黏膜、器官)表面广泛性结节、消瘦、淋巴结肿大、皮肤水肿等。牛结节性皮肤病病毒为双链dna病毒。通过对其dna进行分析表明，其与山羊痘病毒和绵羊痘病毒的基因组核苷酸有96%的同源性。
2、目前，在我国可用山羊痘疫苗用于预防牛结节性皮肤病。山羊痘病毒(goat poxvirus，gpv)为双股dna病毒，属于痘病毒科，山羊痘病毒属成员。该病毒嗜上皮性，没有血清型的区别。病毒容易在羔羊及犊牛的睾丸细胞和肾细胞上生长、繁殖，并致明显的细胞病变（cpe）。
3、专利cn106822888b公开了将山羊痘毒种用无血清mem培养液水化后，按细胞维持液重量0.1%，0.5%，1%，2%的比例接种山羊肾细胞单层，接种时间分别为山羊肾细胞单层铺满程度为80%，100%，接种后置于37°c培养箱培养，病变达到70%以上时，将细胞瓶移到-20°c反复冻融3次，收获病毒液。
4、由于山羊痘疫苗的生产过程依赖于转瓶培养技术，所以短时间内难以进行病毒大量增殖生产，因此研制悬浮细胞化牛结节性皮肤病疫苗病毒抗原成为重要任务。
5、有鉴于此，特提出本专利技术。
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1、本专利技术的目的之一是一种制备山羊肾悬浮细胞的方法。
2、本专利技术的目的之二是一种全悬浮细胞培养牛结节性皮肤病灭活疫苗病毒抗原的方法。
3、根据本专利技术，一种制备山羊肾悬浮细胞的方法，包括：（1）将山羊肾传代细胞复苏；（2）将复苏后的山羊肾传代细胞进行低血清浓度驯化：复苏后的山羊肾传代细胞每45-50小时传代一次，每传3~5代均降低dmem高糖培养液的血清浓度，且山羊肾传代细胞稳定生长，直至培养基血清浓度为2%，由此获得了适宜低血清浓度生长的山羊肾传代细胞；（3）将步骤（2）获得的适宜低血清浓度生长的山羊肾传代细胞进行悬浮培养：将上述山羊肾传代细胞用胰蛋白酶消化，接种于细胞摇瓶进行培养，培养转速为130 r/min；待细胞生长速率趋于稳定后进行传代，传代5~10次，每次传代前将细胞密度调整至1.0×106个ml左右，直至细胞完全失去黏附瓶壁的能力，由此获得以单细胞悬浮方式稳定增殖的山羊肾悬浮细胞。
4、在一个实施方式中，在步骤（2）中，复苏后的山羊肾传代细胞用含6%胎牛血清的dmem高糖培养液连续传代培养3次；然后用含4%胎牛血清的dmem高糖培养液连续传代培养3次；然后用含2%胎牛血清的dmem高糖培养液连续传代培养3次。
5、在一个实施方式中，在步骤（2）中，复苏后的山羊肾传代细胞培养48h，当长成单层后，用胰蛋白酶消化细胞，传代于含6%胎牛血清的dmem高糖培养液中培养，连续传代培养3次；山羊肾传代细胞培养48h，当长成单层后，用 0.25% edta-胰蛋白酶消化细胞，以1：2（v/v）的细胞密度传代于含4%胎牛血清的dmem高糖培养液中培养，连续传代培养3次；山羊肾传代细胞培养48h，当长成单层后，用 0.25% edta-胰蛋白酶消化细胞，以1：2（v/v）的细胞密度传代于含2%胎牛血清的dmem高糖培养液中培养，连续传代培养3次。
6、在一个实施方式中，在步骤（3）中，将步骤（2）获得的适宜低血清浓度生长的山羊肾传代细胞，用胰蛋白酶消化，接种于细胞摇瓶，进行悬浮培养，培养转速为130 r/min； 48小时后，不用胰蛋白酶消化直接收集山羊肾细胞培养液，离心，收集细胞，接种于细胞摇瓶，培养转速为130 r/min，进行培养；按上述步骤，摇瓶培养传代5~10次，待细胞生长速率趋于稳定后进行传代，每次传代前将细胞密度调整至0.9×106个/ml~1.1×106个/ml，直至细胞完全失去黏附瓶壁的能力，由此获得能以单细胞悬浮方式稳定增殖的山羊肾悬浮细胞。
7、山羊肾悬浮细胞摇瓶培养工艺优选为：培养基为bsl培养基，最适细胞接种密度1.0×106个/ml，转速为：130 r/min。
8、根据本专利技术制备山羊肾悬浮细胞的方法获得的山羊肾悬浮细胞，保藏编号是cgmcc no.45735。
9、根据本专利技术，一种山羊肾悬浮细胞培养山羊痘病毒的方法，所述山羊痘病毒用作牛结节性皮肤病灭活疫苗抗原，包括：（1）通过驯化和培养山羊肾传代细胞，制备山羊肾悬浮细胞，（2）将山羊肾悬浮细胞进行摇瓶扩大培养；（3）接种于生物反应器大规模培养山羊肾悬浮细胞；（4）在摇瓶中或者在生物反应器中对山羊肾悬浮细胞接种山羊痘病毒，培养48~72小时，收获病毒液；其中山羊痘病毒摇瓶培养条件为：山羊肾悬浮细胞培养48-96小时接毒，接毒细胞密度为1.0×106~3.0×106个/ml，接毒剂量 moi 为0.1~2，培养温度为35~ 37℃，病毒收获时间为48~72 小时；生物反应器中山羊痘病毒培养条件是：接毒剂量 moi 为0.1~1，生长密度达 个/ml 进行病毒接种。
10、在 15l反应器最佳山羊肾悬浮细胞培养工艺为：最适细胞接种密度 1.0×106 个/ml，转速为： 80-100 r/min；50l反应器最佳山羊肾悬浮细胞培养工艺为：最适细胞接种密度 1.0×106 个/ml，转速为：80-100 r/min；200l 生物反应器最适细胞接种密度 1.0×106个/ml，转速为：60-100r/min。
11、山羊痘病毒av41株的最佳摇瓶培养工艺为：山羊肾悬浮细胞培养72小时接毒，接毒细胞密度为2.0×106个/ml，接毒剂量 moi 为0.1，培养温度为 37℃，病毒收获时间为接毒后72 小时。
12、生物反应器中山羊痘病毒增殖条件为： ph值7.0 ±0.1、温度37 ℃、溶氧（do）50%±10%、转速 40-80 r/min。
13、根据本专利技术的方法，还包括将获得的山羊痘病毒灭活后与佐剂相混合，以制备疫苗。
14、本公开还涉及所述方法获得的山羊痘病毒用于制备牛结节性皮肤病灭活疫苗的用途。
15、本公开还涉及本专利技术的山羊肾悬浮细胞在培养山羊痘病毒中的应用。
16、本专利技术的优势：
17、本专利技术的起始生物材料山羊肾传代细胞相对于原代细胞更加稳定和纯净。原代细胞是从羊体内取肾做成原代细胞，羊体可能会感染其他病原体，其肾细胞可能也会携带其他病原体，包括一些病毒或者支原体。山羊肾传代细胞是可以连续传代的，没有外源病毒的污染，因此更加纯净，性能也更加稳定。传代细胞较原代细胞解决了原代细胞来源难、制备技术复杂、成本高、易污染、安全性存在隐患等难题。
18、悬浮细胞培养山羊痘病毒相对于贴壁细胞培养提高了生产效率和抗原质量，降低了成本本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种制备山羊肾悬浮细胞的方法，其中，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的制备山羊肾悬浮细胞的方法，其中，在步骤（2）中，复苏后的山羊肾传代细胞用含6%胎牛血清的DMEM高糖培养液连续传代培养3次；然后用含4%胎牛血清的DMEM高糖培养液连续传代培养3次；然后用含2%胎牛血清的DMEM高糖培养液连续传代培养3次；
3.根据权利要求1所述的制备山羊肾悬浮细胞的方法，其中，在步骤（3）中，将步骤（2）获得的适宜低血清浓度生长的山羊肾传代细胞用胰蛋白酶消化，接种于细胞摇瓶，进行悬浮培养，培养转速为130 r/min；48小时后，不用胰蛋白酶消化直接收集山羊肾细胞培养液，离心，收集细胞，接种于细胞摇瓶，培养转速为130 r/min，进行培养；按上述步骤，摇瓶培养传代5~10次，待细胞生长速率趋于稳定后进行传代，每次传代前将细胞密度调整至0.9×106个/ml~1.1×106个/ml，直至细胞完全失去黏附瓶壁的能力，由此获得能以单细胞悬浮方式稳定增殖的山羊肾悬浮细胞。
4.根据权利要求1所述的制备山羊肾悬浮细胞的方法，其中，所述山羊肾悬浮细胞的摇瓶
5.根据权利要求1所述的制备山羊肾悬浮细胞的方法，其中，还包括建立山羊肾悬浮细胞种子库。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的制备山羊肾悬浮细胞的方法获得的山羊肾悬浮细胞，保藏编号是CGMCC NO.45735。
7.一种山羊肾悬浮细胞培养山羊痘病毒的方法，所述山羊痘病毒用作牛结节性皮肤病灭活疫苗抗原，所述方法包括：（1）通过驯化和培养山羊肾传代细胞，根据权利要求1-5的方法制备山羊肾悬浮细胞，（2）将所述山羊肾悬浮细胞进行摇瓶扩大培养；（3）接种于生物反应器大规模培养山羊肾悬浮细胞；（4）在摇瓶中或者在生物反应器中对山羊肾悬浮细胞接种山羊痘病毒，培养48~72小时，收获病毒液；其中山羊痘病毒摇瓶培养条件为：山羊肾悬浮细胞培养48-96小时接毒，接毒细胞密度为1.0×106~3.0×106个/ml，接毒剂量 MOI 为0.1~2，培养温度为35~ 37℃，病毒收获时间为48~72 小时；生物反应器中山羊痘病毒培养条件是：接毒剂量 MOI 为0.1~1，生长密度达 个/ml 进行病毒接种。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，在 15L反应器中山羊肾悬浮细胞培养条件为：细胞接种密度 1.0×106 个/ml，转速为： 80-100 r/min；50L反应器中山羊肾悬浮细胞培养条件为：细胞接种密度 1.0×106 个/ml，转速为：80-100 r/min；200L 生物反应器中细胞接种密度是 1.0×106个/ml，转速为：60-100r/min；
9.权利要求7或8所述的方法获得的山羊痘病毒用于制备牛结节性皮肤病灭活疫苗的用途。
10.权利要求6所述的山羊肾悬浮细胞在培养山羊痘病毒中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种制备山羊肾悬浮细胞的方法，其中，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的制备山羊肾悬浮细胞的方法，其中，在步骤（2）中，复苏后的山羊肾传代细胞用含6%胎牛血清的dmem高糖培养液连续传代培养3次；然后用含4%胎牛血清的dmem高糖培养液连续传代培养3次；然后用含2%胎牛血清的dmem高糖培养液连续传代培养3次；
3.根据权利要求1所述的制备山羊肾悬浮细胞的方法，其中，在步骤（3）中，将步骤（2）获得的适宜低血清浓度生长的山羊肾传代细胞用胰蛋白酶消化，接种于细胞摇瓶，进行悬浮培养，培养转速为130 r/min；48小时后，不用胰蛋白酶消化直接收集山羊肾细胞培养液，离心，收集细胞，接种于细胞摇瓶，培养转速为130 r/min，进行培养；按上述步骤，摇瓶培养传代5~10次，待细胞生长速率趋于稳定后进行传代，每次传代前将细胞密度调整至0.9×106个/ml~1.1×106个/ml，直至细胞完全失去黏附瓶壁的能力，由此获得能以单细胞悬浮方式稳定增殖的山羊肾悬浮细胞。
4.根据权利要求1所述的制备山羊肾悬浮细胞的方法，其中，所述山羊肾悬浮细胞的摇瓶培养工艺为：培养基为bsl培养基，细胞接种密度1.0×106个/ml，转速为：130 r/min。
5.根据权利要求1所述的制备山羊肾悬浮细胞的方法，其中，还包括建立山羊肾悬浮细胞种子库。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的制备山羊肾悬浮细胞的方法获得的山羊肾悬浮细胞，...
【专利技术属性】
技术研发人员：薛青红，孙淼，陈延飞，陈建，李岭，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：
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