一种鸭肠炎病毒毒株及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体公开了一种鸭肠炎病毒毒株及其制备方法与应用。本发明专利技术的鸭肠炎病毒毒株的US4基因缺失第468

【技术实现步骤摘要】
一种鸭肠炎病毒毒株及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地说，涉及一种鸭肠炎病毒毒株及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]鸭病毒性肠炎(Duck viral enteritis，DVE)又称为鸭瘟(Duck plague，DP)，是鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus，DEV)引起的一种只感染雁形目禽类的急性、热性、接触性传染病，此病传播广泛，给水禽养殖业带来巨大损失。鸭病毒性肠炎对不同性别和年龄的鸭均可致病，对成年鸭的危害最为严重，其特征为侵害血管、消化道黏膜糜烂、组织出血、淋巴器官病变及其实质器官有退行性病变。康复后的鸭仍可能带毒和排毒，导致该病在鸭群中广泛地传播，严重的影响了养鸭业的发展，是危害养鸭业的最为严重的传染病之一。
[0003]鸭肠炎病毒属于疱疹病毒科、α
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疱疹病毒亚科、马立克病毒属、鸭疱疹病毒1型。鸭肠炎病毒具有疱疹病毒典型形态结构，并且不同毒株之间均可产生交互免疫。病毒粒子为大的球形且带囊膜，直径为120～200nm，结构主要由衣壳、外膜、囊膜、核心4部分组成。DEV病毒衣壳为二十面体对称，外观呈六角形，由162个相互连接呈放射状排列并且有中空轴孔的壳粒组成，核心是由双股线状DNA与蛋白缠绕而成，直径约为35～40nm。李玉峰等应用Shot
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gun方法，首次完成了鸭瘟商品化疫苗(DEV VAC)的全基因组测序。结果表明，DEV VAC基因组全长158,089bp，G+C含量为44.91％，由长独特区(Unique Long,UL)和短独特区(Unique Short,US)组成，US区两端为一对反向重复序列，分别称为内部重复序列(Internal Repeat,IR)和末端重复序列(Terminal Repeat,TR)。基因组结构为UL
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IR
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US
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TR，呈典型的D型疱疹病毒基因组结构。目前，关于鸭肠炎病毒基因研究取得了一定的进展，但其分子病毒学方面研究有待进一步深入。
[0004]重组活载体疫苗通常是以动物病原弱毒或无毒株为载体，通过同源重组、Fosmid多片段拯救系统、细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)、CRISPR/Cas9系统等基因编辑技术操控病毒载体基因组，插入并表达外源抗原基因，接种这种重组疫苗以后，不仅能对原病毒产生保护力，还获得对插入基因相关疾病的保护力。同时一个载体可以表达多个免疫基因可获得多价苗或多联疫苗。DEV作为活疫苗载体具有以下优点：(1)DEV庞大而复杂的基因组为外源基因提供了诸多可插入位点；(2)DEV免疫原性好，免疫后3日即可产生一定的保护；(3)免疫保持期长，可达1年。然而，外源基因的插入位点直接影响DEV毒力、外源基因表达及其免疫原性等多个方面，在研究确定可同时兼顾多方面效果的最佳插入位点时，并没有统一的标准和规律，因此有必要对相关疫苗载体进行进一步研究。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的之一是提供一种新的可提供良好免疫保护的鸭肠炎病毒毒株及其应用。
[0006]为了实现该目的，本专利技术的技术方案如下：
[0007]本专利技术提供一种鸭肠炎病毒毒株，所述鸭肠炎病毒毒株的US4基因缺失第468
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1362位碱基。
[0008]野生US4基因的序列参见SEQ ID No.11。
[0009]本专利技术构建了一株携带荧光标记和黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶(gpt)基因并具有US4基因特定位点缺失的重组鸭肠炎病毒。该病毒可通过反向筛选、敲除荧光和gpt标记，获得US4基因特定位点缺失的重组鸭肠炎病毒。该病毒对鸭无致病性，且具有良好的免疫原性，能够实现抗鸭肠炎病毒的免疫保护。可将其作为疫苗种毒用于生产鸭瘟活疫苗；该病毒还作为活病毒载体，表达外源基因，如非鸭瘟病毒抗原的基因。
[0010]本专利技术的鸭肠炎病毒毒株还包括荧光蛋白基因和gpt基因，所述荧光蛋白基因和gpt基因插入在所述US4基因缺失碱基的位置。
[0011]插入荧光蛋白和gpt基因有利于病毒的鉴别。优选，所述荧光蛋白基因表达的蛋白产生红色荧光，gpt基因表达黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶，所述gpt基因位于所述荧光蛋白基因的下游并与之串联；更优选所述荧光蛋白基因和gpt基因构成的序列如SEQ ID No.12所示。
[0012]本专利技术所述鸭肠炎病毒毒株进一步还包括外源病毒基因，所述外源病毒基因插入在所述US4基因缺失碱基的位置并位于所述荧光蛋白基因和gpt基因的下游。
[0013]所述外源病毒基因指除了鸭肠炎病毒以外的病毒基因，优选为禽副黏病毒1型F基因、禽流感病毒HA基因、病毒性肝炎VP1基因、细小病毒VP3基因或鸭坦布苏病毒E蛋白基因。
[0014]在重组活载体疫苗的制备中，会出现大量外源病毒基因导入活病毒载体后不兼容的现象，使得外源病毒基因无法大量表达，导致外源病毒的免疫原性很低，无法实现相应的免疫效果。而以本专利技术的US4基因具有特定位点缺失的毒株作为载体，插入外源病毒基因后，可获得良好的外源病毒免疫原性。因此本专利技术提供的该毒株可作为制备基因工程活载体疫苗的理想组分。
[0015]本专利技术还提供一种构建鸭肠炎病毒毒株的方法，其包括：
[0016](1)亲本病毒的培育：将鸭肠炎病毒强毒株经传代获得的克隆纯化弱毒株作为亲本毒株；
[0017](2)转移载体的构建：构建US4基因缺失第468
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1362位碱基，并在缺失位置处插入荧光蛋白基因和gpt基因的转移载体；
[0018](3)重组鸭肠炎病毒的构建：将步骤(2)获得的转移载体与步骤(1)获得的亲本毒株共转染至宿主细胞，通过克隆筛选，获得US4基因缺失第468
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1362位碱基，并在缺失位置处插入荧光蛋白基因和gpt基因的鸭肠炎病毒毒株；
[0019]或者，进一步包括(4)敲除荧光蛋白基因和gpt基因：将步骤(3)获得的鸭肠炎病毒毒株中的荧光蛋白基因和gpt基因通过反向筛选敲除，获得仅US4基因缺失第468
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1362位碱基的鸭肠炎病毒毒株。
[0020]本专利技术在制备进一步表达外源病毒基因的毒株时，在步骤(3)获得US4基因缺失第468
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1362位碱基，并在缺失位置处插入荧光蛋白基因的鸭肠炎病毒毒株后，还包括在荧光蛋白基因下游插入外源病毒基因的步骤。
[0021]作为一个优选方案，本专利技术提供了一种重组病毒，其同时表达禽副黏病毒1型F蛋白和红色荧光蛋白(RFP)，对副黏病毒1型具有良好的保护效果，且携带红色荧光蛋白标记，
有利于鉴别。
[0022]作为一个具体实施方式，该毒株的构建包括下述步骤：
[0023](1)亲本病毒的培育：将鸭瘟病毒CVCC AV1221强毒株经鸡胚成纤维细胞和鸡胚连续传代获得的克隆纯化弱毒株作为亲本毒株；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鸭肠炎病毒毒株，其特征在于，所述鸭肠炎病毒毒株的US4基因缺失第468
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1362位碱基。2.根据权利要求1所述的鸭肠炎病毒毒株，其特征在于，所述鸭肠炎病毒毒株还包括荧光蛋白基因和gpt基因，所述荧光蛋白基因和gpt基因插入在所述US4基因缺失碱基的位置。3.根据权利要求2所述的鸭肠炎病毒毒株，其特征在于，所述荧光蛋白基因表达的蛋白产生红色荧光，所述gpt基因位于所述荧光蛋白基因的下游并与之串联；优选所述荧光蛋白基因和gpt基因构成的序列如SEQ ID No.12所示。4.根据权利要求2或3所述的鸭肠炎病毒毒株，其特征在于，所述鸭肠炎病毒毒株进一步还包括外源病毒基因，所述外源病毒基因插入在所述US4基因缺失碱基的位置并位于所述荧光蛋白基因和gpt基因的下游。5.根据权利要求4所述的鸭肠炎病毒毒株，其特征在于，所述外源病毒基因为禽副黏病毒1型F基因、禽流感病毒HA基因、病毒性肝炎VP1基因、细小病毒VP3基因或鸭坦布苏病毒E蛋白基因。6.一种构建鸭肠炎病毒毒株的方法，其特征在于，包括：(1)亲本病毒的培育：将鸭肠炎病毒强毒株经传代获得的克隆纯化弱毒株作为亲本毒株；(2)转移载体的构建：构建US4基因缺失第468
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1362位...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨承槐，苗清新，宋亚芬，杨宵玥，张敏，张兵，陈玲，王静文，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：