血清PSMD4蛋白的检测试剂盒及其检测方法与应用技术

本发明专利技术属于免疫学和生物技术领域，具体涉及一种血清PSMD4蛋白的检测试剂盒及其检测方法与应用，本发明专利技术提供的PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒及其检测方法可用于多种恶性肿瘤(特别是肺癌、胃癌和结直肠癌)的血清学诊断以及肿瘤筛查。本发明专利技术操作简单方便，可准确、高灵敏度地检测到恶性肿瘤病人血清中的PSMD4蛋白的含量，为临床检验和基础研究提供了一种新的手段和方法。

【技术实现步骤摘要】
血清PSMD4蛋白的检测试剂盒及其检测方法与应用
本专利技术属于免疫学和生物
，具体涉及一种PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒及其检测方法与在多种恶性肿瘤(肺癌、胃癌和结直肠癌)血清学诊断以及肿瘤筛查中的应用。
技术介绍
癌症(cancer)泛指所有的恶性肿瘤。据世界卫生组织统计，全球癌症患者每年新增1400多万，中国成为世界上受癌症影响最严重的国家。中国大陆的癌症发病率几乎占了全球的一半。在中国范围内癌症在各种死因中也已经排在第二位，在城市则已经排在首位。其中肺癌病死率上升最快，已经排在恶性肿瘤死亡率中的第一位。其次是肝癌、胃癌和结直肠癌。令人担忧的是，未来10年，中国的癌症发病率与死亡率仍将继续攀升。因此，癌症的早期诊断对延长患者的生存时间和降低患者死亡率具有重要意义。目前癌症的诊断主要依靠实验室检查、影像学检查以及病理检查相结合。但是影像学检查和病理检查都没有办法大规模筛选出早期癌症患者。而实验室检查则需要借助多种肿瘤免疫标志物检测来指导临床诊断。目前用于临床的肿瘤标志物有很多种，如AFP是肝癌最有诊断价值的指标，结肠癌的血清癌胚抗原(CEA)；胃癌的胃液硫糖蛋白(FSA)、胃癌相关抗原(GCAA)、前列腺癌的前列腺特异性抗原(PSA)等。但是据近年研究报道，各种肿瘤标志物都存在着容易漏诊和误诊的问题。目前临床还没有特异性好、敏感性高的肿瘤标志物可以用于多种癌症患者的大规模筛选。因此，临床仍需要高度敏感的恶性肿瘤特异标志物用于癌症患者的大规模人群的初步筛查，进而提高恶性肿瘤的早期诊断率。恶性肿瘤血清标志物的研究一直是科学家们研究的重点，但大多数研究成果难以满足实际应用的需要。探索高敏感性及特异性的血清学指标尤为重要。本专利技术中的研究对象—PSMD4蛋白，是一个蛋白酶体26S非ATP酶亚基4(GeneID:5710)。该分子含有两段15个氨基酸的泛素相互作用模序(ubiquitininteractingmotif,UIM)，能够选择性结合泛素化蛋白，介导蛋白质降解。已有研究报道，PSMD4异常表达与炎症性肠病、溃疡性结肠炎等疾病相关，PSMD4在恶性肿瘤中的表达及生物学功能尚不十分清楚。有研究显示，PSMD4可能与细胞分化和机体发育有关(参见文献：Hamazaki,J.,etal.,Rpn10-mediateddegradationofubiquitinatedproteinsisessentialformousedevelopment.MolCellBiol,2007.27(19):p.6629-38)。我们发现PSMD4是一个重要的癌蛋白，并且可以释放入血。本申请人已就PSMD4作为肝癌预后诊断标志物的新用途申请了中国专利CN201310005491.4，专利技术名称为“PSMD4蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用”，公开号为CN103091493A。目前尚无文献报道在肿瘤病人血清样品中准确检测到PSMD4蛋白；也尚无针对肿瘤病人血清样品中PSMD4蛋白含量提供一种准确、简便、灵敏度高的检测手段；也尚无文献报道PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒以及该类试剂盒在肿瘤血清学诊断和筛查中的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒；本专利技术的另一目的是提供利用上述试剂盒的检测方法；本专利技术的第三目的是提供上述试剂盒在多种恶性肿瘤(如肺癌、胃癌、结直肠癌等)血清学诊断和筛查中的应用。本专利技术旨在为临床和实验室多种恶性肿瘤血清样品中PSMD4蛋白含量提供准确、简便、灵敏度高、并可被广泛使用的检测手段。本专利技术人经过广泛而深入的研究，采用酶联免疫吸附法检测PSMD4蛋白在多种恶性肿瘤病人血清中的表达水平，并首次证实在多种恶性肿瘤病人的血清中存在PSMD4蛋白的高表达。本专利技术第一方面，提供了一种PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒，所述的ELISA检测试剂盒包括：(1)包被有PSMD4抗体的ELISA酶标板，所述的包被抗体为兔抗人PSMD4的多克隆抗体；较优的，兔抗人PSMD4的多克隆抗体购自PTG公司；最优的，抗体工作浓度为2μg/ml。(2)检测PSMD4抗原的抗体，为小鼠抗人PSMD4的单克隆抗体；较优的，小鼠抗人PSMD4的单克隆抗体购自PTG公司；最优的，检测抗体的工作浓度为0.5μg/ml。(3)酶标二抗，HRP(辣根过氧化物酶)标记的山羊抗小鼠IgG；较优的，HRP标记的山羊抗小鼠IgG购自PTG公司；最佳的，稀释浓度为1:5000。(4)标准蛋白，为重组人PSMD4融合蛋白；较优的，重组人PSMD4融合蛋白购自PTG公司。(5)所述的试剂盒，还包括有：常规的样品稀释液、包被缓冲液、封闭液、ELISA酶标板洗涤液、抗体稀释液、显色液和终止液；所述的试剂盒，ELISA酶标板为市售的ELISA酶标板，优选德国greiner公司的ELISA酶标板(96孔单条可拆酶标板#650180)；包被缓冲液，选用sigam公司的1×PBS，pH:9.6；封闭液，选用含3％牛血清白蛋白+PBS溶液的封闭液；ELISA酶标板洗涤液，较优的为含0.05％Tween-20的1×PBS溶液；样品稀释液：样品为血清时，较优的为1×PBS，pH:7.4；抗体稀释液，选用1×PBS；显色液，选用sigam公司的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)；终止液，较优的为2mol/L的硫酸溶液。本专利技术所述的一种PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒，所用的试剂、条件进一步优化：(1)包被抗体的优化：本专利技术的试剂盒，分别选用不同的抗体包被：兔抗人PSMD4的多克隆抗体(Abnova公司，#H00005710-AP11-1)、兔抗人PSMD4的多克隆抗体(PTG公司，#14899-1-AP)，鼠抗人PSMD4的单克隆抗体(Abnova公司，#H00005710-AP11-2)、鼠抗人PSMD4的单克隆抗体(PTG公司，#66179-1-Ig)，检测浓度选用7.5μg/ml，5μg/ml，2.0μg/ml，1μg/ml，0.5μg/ml，0.25μg/ml。结果发现选用兔抗人PSMD4的多克隆抗体(Abnova公司，#H00005710-AP11-1)、鼠抗人PSMD4的单克隆抗体(Abnova公司，#H00005710-AP11-2；PTG公司，#66179-1-Ig)作为包被抗体均存在明显的非特异反应，标准品的浓度和吸光度数值没有相关性；但是使用兔抗人PSMD4的多克隆抗体(PTG公司，#14899-1-AP)则没有明显的非特异性反应，标准品的浓度和吸光度具有较好的相关性。经过反复优化，抗体工作浓度2μg/ml为最佳，标准品的浓度和吸光度数值的相关性最好。(2)检测抗体的优化：本专利技术的试剂盒，分别选用不同的抗体作为检测抗体：当包被抗体为兔抗人PSMD4的两种多克隆抗体(Abnova公司；#H00005710-AP11-1；PTG公司，#14899-1-AP)时选用鼠抗人PSMD4的两种单克隆抗体(Abnova公司，#H00005710-AP11-2；PTG公司，#66179-1-Ig)分别作为检测抗体；当包被抗体为鼠抗人PSMD4的两种单克隆抗体(Abnova公司，#H000本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒在制备恶性肿瘤血清学诊断或筛查试剂盒中的应用。

【技术特征摘要】
1.一种PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒在制备恶性肿瘤血清学诊断或筛查试剂盒中的应用。2.根据权利要求1所述的一种PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒在制备恶性肿瘤血清学诊断或筛查试剂盒中的应用，其特征在于，所述的恶性肿瘤是肺癌、胃癌，或结直肠癌。3.根据权利要求1或2所述的一种PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒在制备恶性肿瘤血清学诊断或筛查试剂盒中的应用，其特征在于，所述的PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒包括：(A)包被有PSMD4抗体的ELISA酶标板，所述的包被抗体为兔抗人PSMD4的多克隆抗体；(B)检测PSMD4抗原的抗体，为小鼠抗人PSMD4的单克隆抗体；(C)酶标二抗，为HRP标记的山羊抗小鼠IgG；(D)标准蛋白，为重组人PSMD4融合蛋白；(E)样品稀释液、包被缓冲液、封闭液、ELISA酶标板洗涤液、抗体稀释液、显色液和终止液。4.根据权利要求3所述的一种PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒在制备恶性肿瘤血清学诊断或筛查试剂盒中的应用，其特征在于，所述的ELISA酶标板为96孔的ELISA酶标板。5.根据权利要求3所述的一种PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒在制备恶性肿瘤血清学诊断或筛查试剂盒中的应用，其特征在于，所述的ELISA检测试剂盒中，包被缓冲液，为1×PBS，pH:7.4；封闭液，为含3％牛血清白蛋白+PBS溶液的封闭液；ELISA酶标板洗涤液，为含0.05％Tween-20的1×PBS溶液；抗体稀释液，为1×PBS；显色液，为3,3′,5,5′-四甲基联苯胺；终止液，为2mol/L的硫酸溶液。6.根据权利要求3所述的一种PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒在制备恶性肿瘤血清学诊断或筛查试剂盒中的应用，其特征在于，所述的ELISA检测试剂盒中，当样品为血清时，样品稀释液为1×PBS，pH:7.4。7.根据权利要求3所述的一种PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒在制备恶性肿瘤血清学诊断或筛查试剂盒中的应用，其特征在于，所述的试剂盒用于血清学诊断或筛查的方法包括以下步骤：制备检测ELISA酶标板：...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁劲，李晓峰，程卓，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海,31