本发明专利技术公布了一种肿瘤蛋白的检测试剂盒，包括肿瘤蛋白P185单克隆抗体、酶标板、阳性对照品、阴性对照品、洗涤液、终止液、辣根过氧化物酶‑链亲和素及其显色底物，所述的肿瘤蛋白P185单克隆抗体包括包被在酶标板上的肿瘤蛋白P185单克隆抗体和生物素标记的肿瘤蛋白P185单克隆抗体。该检测试剂盒具有高灵敏性、高特异性及稳定性，用于乳腺、卵巢、肺、胃、肝等十余种癌症血清中P185的检测，这对上述肿瘤的筛查、诊断与治疗具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学和医学领域，具体涉及一种肿瘤蛋白的检测试剂盒。
技术介绍
癌基因HER-2/neu编码的一种重要的肿瘤表面标记蛋白，在乳腺、卵巢、肺、胃、肝等十余种癌症患者中均显示有过量表达，P185过量表达的患者肿瘤恶性程度高，术后易发生转移和复发，并且对化疗药物治疗具有抗性，因此检测肿瘤抗原P185的表达水平，对多种肿瘤的鉴别诊断、分类预示疗效以及治疗方案的选择均有重要意义，尤其是乳腺癌，P185已是国际公认的一个重要的临床指标。与检测肿瘤组织中肿瘤蛋白P185的表达相比，检测病人血清中肿瘤蛋白P185的表达简便易行，但是目前国内尚未建立检测患者的血清中P185的试剂盒，因此研发出高灵敏性、高特异性及稳定性的P185检测试剂盒，用于乳腺、卵巢、肺、胃、肝等十余种癌症血清中P185的检测，这对上述肿瘤的筛查、诊断与治疗具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种肿瘤蛋白检测试剂盒，该试剂盒精密性高、稳定性好。本专利技术的通过下述技术方案实现：一种肿瘤蛋白的检测试剂盒，包括肿瘤蛋白P185单克隆抗体、酶标板、阳性对照品、阴性对照品、洗涤液、终止液、辣根过氧化物酶-链亲和素及其显色底物，所述的肿瘤蛋白P185单克隆抗体包括包被在酶标板上的肿瘤蛋白P185单克隆抗体和生物素标记的肿瘤蛋白P185单克隆抗体。优选，所述的包被在酶标板上的肿瘤蛋白P185单克隆抗体为肿瘤蛋白P185单克隆抗体2D11，所述的生物素标记的肿瘤蛋白P185单克隆抗体为肿瘤蛋白P185单克隆抗体3F9，肿瘤蛋白P185单克隆抗体2D11、3F9的制备步骤如下：a)以NIH/3T3细胞i.p免疫第一批6～8周的Balb/C雌鼠，得到雌鼠的抗NIH/3T3血清；b)收集长至汇合的T6-17细胞，用PBS缓冲液洗三次，将上述制备的抗NIH/3T3抗血清用PBS缓冲液以1:20～100稀释，然后取2ml加入T6-17细胞中，在4℃条件下温育过夜，期间晃动盛放T6-17细胞的试管8-10次，然后再用PBS缓冲液洗三次，得到悬浮于PBS缓冲液中的T6-17细胞；c)用上述悬浮于PBS缓冲液中的T6-17细胞i.p免疫第二批6-8周的BaLb/C雌鼠，然后取雌鼠的脾细胞制成细胞悬液；d)将步骤c得到的细胞悬液与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；e)用ELISA法从上述融合的细胞中筛选出分泌肿瘤蛋白P185单克隆抗体的杂交瘤细胞，采用有限稀释法对杂交瘤细胞进行克隆化，从而得到两株具有稳定分泌肿瘤蛋白P185单克隆抗体能力的杂交瘤细胞株，分别命名为杂交瘤细胞株2D11、杂交瘤细胞株3F9；f)将杂交瘤细胞株2D11、3F9分别注入不同的雌鼠体内，收集腹水，将腹水中的抗体纯化，即得肿瘤蛋白P185单克隆抗体2D11、3F9。优选，所述的洗涤液是由28.8g的Na2HPO4·12H2O、80g的NaCl、3.9g的NaH2PO4·2H2O和50ml的Tween-20加入纯化水溶解定容至100000ml所得。优选，所述显色底物包括显色液A和显色液B，所述的显色液A是用柠檬酸缓冲液将30％过氧化氢稀释1000倍所得，所述的显色液B为用含20％二甲基亚砜的柠檬酸缓冲液将四甲基联苯胺配制成0.4mg/ml所得。优选，所述终止液是浓度为2mol/L的硫酸溶液。优选，所述阳性对照品、阴性对照品分别为人体的P185阳性血清、P185阴性血清。本专利技术与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：本专利技术在常规酶联免疫吸附试验的基础上，通过生物素与辣根过氧化物酶-链亲和素之间的高度放大作用，建立了一种高灵敏度生物素-亲和素-酶联免疫检测试剂盒，以测定待测样中的肿瘤蛋白表达水平。亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，分子量为68kDa，由4个亚单位组成，对生物素有非常高的亲和力，其结合常数高达1015M-1；所述的生物素很易与抗体等蛋白质以共价键结合，这样结合有酶的辣根过氧化物酶-链亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应的显色底物时发生催化作用而呈色，从而达到检测目标抗原或抗体分子的目的，采用本专利技术的肿瘤蛋白P185检测试剂盒可以有效、稳定地测定人体血清中的肿瘤蛋白P185水平，其灵敏度高，测试重复性好。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本专利技术作进一步的详细说明，本专利技术的示意性实施方式及其说明仅用于解释本专利技术，并不作为对本专利技术的限定。以下对肿瘤蛋白检测试剂盒的制备、使用步骤以及使用效果进一步说明：1、肿瘤蛋白P185检测试剂盒的制备1)常规器材及试剂的准备：96孔酶标板、P185阳性血清、P185阴性血清、洗涤液、终止液、辣根过氧化物酶-链亲和素以及显色液A、显色液B，其中P185阳性血清和P185阴性血清的符合率达100％。2)肿瘤蛋白P185单克隆抗体的制备：a)收集NIH/3T3细胞i.p免疫第一批6～8周的Balb/C雌鼠，NIH/3T3细胞的每次使用剂量为107/只，每隔两周一次，三次后从雌鼠尾部取血，用ELISA法测血清滴度，将滴度最高的雌鼠再用同量的NIH/3T3细胞进行i.p免疫，七天后从该雌鼠的眼窝取血，即得雌鼠的抗NIH/3T3血清；b)收集长至汇合的T6-17细胞，采用PBS缓冲液(即磷酸盐缓冲液)洗三次，所述的T6-17细胞为转染Her-2/neu癌基因的NIH/3T3细胞，其膜表面高表达肿瘤蛋白P185，将上述制备的抗NIH/3T3血清用PBS缓冲液以1:50的比例稀释，然后取2ml加入T6-17细胞中，在4℃条件下温育过夜，期间晃动盛放T6-17细胞的试管9次以使细胞悬浮，然后再用PBS缓冲液洗三次，得到悬浮于PBS缓冲液中的T6-17细胞；c)用上述悬浮于PBS缓冲液中的T6-17细胞i.p免疫第二批6-8周的BaLb/C雌鼠，剂量为107/小只，在第1周、第3周和第6周各一次，第7周从雌鼠的尾部取血，用ELISA法测血清滴度，将滴度最高的雌鼠再用同量的T6-17细胞i.p免疫，三天后取该雌鼠的脾细胞制成细胞悬液；d)将步骤c得到的细胞悬液与骨髓瘤细胞SP2/0混合，并在融合剂PEG的作用下进行细胞融合，所述的骨髓瘤细胞SP2/0由中国科学院上海细胞库提供；e)用ELISA法从上述融合的细胞中筛选出分泌肿瘤蛋白P185单克隆抗体的杂交瘤细胞，采用有限稀释法对杂交瘤细胞进行克隆化，从而得到两株具有稳定分泌肿瘤蛋白P185单克隆抗体能力的杂交瘤细胞株，分别命名为杂交瘤细胞株2D11和杂交瘤细胞株3F9，f)将杂交瘤细胞株2D11和3F9分别注入不同的雌鼠体内，收集腹水，采用ProteanA亲和层析法将腹水中的抗体纯化即得肿瘤蛋白P185单克隆抗体2D11和3F9，纯化抗体的方法也可以采用聚乙二醇沉淀法等常规的方法，肿瘤蛋白P185单克隆抗体2D11和3F9纯化前后的SDS-PAGE分析结果，其中第1泳道为肿瘤蛋白P185单克隆抗体纯化前的SDS-PAGE分析结果，第2泳道为肿瘤蛋白P185单克隆抗体纯化后的SDS-PAGE分析结果，可以看出纯化后的肿瘤蛋白P185单克隆抗体2D11和3F9仅存一本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肿瘤蛋白的检测试剂盒，其特征在于：包括肿瘤蛋白P185单克隆抗体、酶标板、阳性对照品、阴性对照品、洗涤液、终止液、辣根过氧化物酶‑链亲和素及其显色底物，所述的肿瘤蛋白P185单克隆抗体包括包被在酶标板上的肿瘤蛋白P185单克隆抗体和生物素标记的肿瘤蛋白P185单克隆抗体；所述的包被在酶标板上的肿瘤蛋白P185单克隆抗体为肿瘤蛋白P185单克隆抗体2D11，所述的生物素标记的肿瘤蛋白P185单克隆抗体为肿瘤蛋白P185单克隆抗体3F9，肿瘤蛋白P185单克隆抗体2D11、3F9的制备步骤如下： a）以NIH/3T3细胞i.p免疫第一批6～8周的Balb/C雌鼠，得到雌鼠的抗NIH/3T3血清； b）收集长至汇合的T6‑17细胞，用PBS缓冲液洗三次，将上述制备的抗NIH/3T3抗血清用PBS缓冲液以1:20～100稀释，然后取2ml加入T6‑17细胞中，在4℃条件下温育过夜，期间晃动盛放T6‑17细胞的试管8‑10次，然后再用PBS缓冲液洗三次，得到悬浮于PBS缓冲液中的T6‑17细胞； c）用上述悬浮于PBS缓冲液中的T6‑17细胞i.p免疫第二批6‑8周的BaLb/C雌鼠，然后取雌鼠的脾细胞制成细胞悬液； d）将步骤c得到的细胞悬液与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；e）用ELISA法从上述融合的细胞中筛选出分泌肿瘤蛋白P185单克隆抗体的杂交瘤细胞，采用有限稀释法对杂交瘤细胞进行克隆化，从而得到两株具有稳定分泌肿瘤蛋白P185单克隆抗体能力的杂交瘤细胞株，分别命名为杂交瘤细胞株2D11、杂交瘤细胞株3F9； f）将杂交瘤细胞株2D11、3F9分别注入不同的雌鼠体内，收集腹水，将腹水中的抗体纯化，即得肿瘤蛋白P185单克隆抗体2D11、3F9。...
【技术特征摘要】
1.一种肿瘤蛋白的检测试剂盒，其特征在于：包括肿瘤蛋白P185单克隆抗体、酶标板、阳性对照品、阴性对照品、洗涤液、终止液、辣根过氧化物酶-链亲和素及其显色底物，所述的肿瘤蛋白P185单克隆抗体包括包被在酶标板上的肿瘤蛋白P185单克隆抗体和生物素标记的肿瘤蛋白P185单克隆抗体；所述的包被在酶标板上的肿瘤蛋白P185单克隆抗体为肿瘤蛋白P185单克隆抗体2D11，所述的生物素标记的肿瘤蛋白P185单克隆抗体为肿瘤蛋白P185单克隆抗体3F9，肿瘤蛋白P185单克隆抗体2D11、3F9的制备步骤如下：a）以NIH/3T3细胞i.p免疫第一批6～8周的Balb/C雌鼠，得到雌鼠的抗NIH/3T3血清；b）收集长至汇合的T6-17细胞，用PBS缓冲液洗三次，将上述制备的抗NIH/3T3抗血清用PBS缓冲液以1:20～100稀释，然后取2ml加入T6-17细胞中，在4℃条件下温育过夜，期间晃动盛放T6-17细胞的试管8-10次，然后再用PBS缓冲液洗三次，得到悬浮于PBS缓冲液中的T6-17细胞；c）用上述悬浮于PBS缓冲液中的T6-17细胞i.p免疫第二批6-8周的BaLb/C雌鼠，然后取雌鼠的脾细胞制成细胞悬液；d）将步骤c得到的细胞悬液与骨髓瘤细胞SP2...
【专利技术属性】
技术研发人员：周炜，欧阳小峰，魏徵霄，毛家丽，
申请(专利权)人：四川金域医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51
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