铁蛋白定量检测试剂盒、其制备及使用方法技术

本发明专利技术属于医疗卫生技术领域，具体提供一种铁蛋白定量检测试剂盒，包括衬板，所述衬板的上表面依次搭接设置有样品垫、结合垫、NC膜以及吸收垫，所述NC膜上设置有检测线和质控线，NC膜的检测线处包被第二鼠抗铁蛋白单克隆抗体，所述NC膜的质控线包被羊抗鸡IgY多抗抗体；所述结合垫处设置有第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体标记的荧光微球和鸡IgY标记的荧光微球。相应的，本发明专利技术还提供了所述蛋白定量检测试剂盒的制备及使用方法。本发明专利技术结合荧光免疫层析技术和时间分辨免疫荧光理论，进行铁蛋白检测时具有操作简便、能够实现即时检测、并且灵敏度高、特异性好的优点。实现一次加样，10min读取测试结果，灵敏度可达2.5ng/ml。

Ferritin quantitative detection kit, preparation and use method thereof

The invention belongs to the technical field of medical and health, a ferritin quantitative detection kit specifically provides, including lining plate, are lapped surface of the lining board is provided with a sample pad, combination pad, NC membrane and the absorbent pad, the NC film is arranged on the test line and control line, detection of NC film package by second mouse anti ferritin monoclonal antibody, quality control line of the NC film coated with Goat anti chicken IgY polyclonal antibody; combined with fluorescent microspheres with fluorescent microspheres first mouse anti ferritin labeled monoclonal antibody and IgY labeled chicken at the pad set. Accordingly, the invention also provides the preparation and the use method of the protein quantitative detection kit. The method combines the fluorescence immunity chromatography technique and the time resolved immunofluorescence theory to detect the ferritin, and has the advantages of simple operation, immediate detection, high sensitivity and good specificity. To achieve a sampling, 10min read the test results, sensitivity of up to 2.5ng/ml.

【技术实现步骤摘要】
铁蛋白定量检测试剂盒、其制备及使用方法
本专利技术属于医疗卫生
，具体涉及一种铁蛋白定量检测试剂盒、其制备及使用方法。
技术介绍
目前基于胶体金法或第一代荧光法的检测试剂，在定量检测精密度和准确性以及操作便利性方面还存在严重的缺陷。第一代荧光检测法的铁蛋白试剂大部分都是利用普通的荧光物质进行标记。普通的荧光物质Stokes位移小，激发光谱和发射光谱常有重叠，相互干扰，影响检测结果的准确性；普通荧光物质的荧光寿命非常短，激发光消失，荧光也消失。而且在生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光，对检测结果产生严重的干扰。1942年Wissman发现，某些β-二酮与铕配合后可吸收紫外光，发出强烈的铕离子的特征荧光。1979年，芬兰SoiniHemmia提出时间分辨荧光免疫分析理论；2003年，上海新波生物技术有限公司应用该技术推出了首个体外诊断产品。目前，也有少数公司利用时间分辨免疫分析理论，做出了铁蛋白定量检测试剂，但是，这些铁蛋白定量检测试剂均需要加样、孵育、洗涤等步骤，操作复杂，检测时间长，而且需要专业人士操作，还不能做到即时检测。综上，为了解决传统铁蛋白检测存在的易受本底荧光干扰、灵敏度低、特异性差、操作复杂、检测时间长并且不能做到即时检测等不足，一种新的铁蛋白定量检测技术亟待开发。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的上述问题，本专利技术提供了一种操作简便、能够实现即时检测、并且灵敏度高、特异性好的铁蛋白定量检测试剂盒。本专利技术还相应提供了所述铁蛋白定量检测试剂盒的制备方法，所述制备方法能够进一步提升所制得的铁蛋白定量检测试剂盒用于检测铁蛋白的灵敏度和特异性。同时，本专利技术还相应的提供了所述铁蛋白定量检测试剂盒的使用方法，该使用方法能够消除试剂盒的本底荧光干扰，进一步提升检测结果的灵敏度和特异性。本专利技术的设计思路：非常少的稀土金属(Eu、Tb、Sm、Dy)的荧光寿命较长，可达1～2ms，能够满足测量要求，因此而产生了时间分辨荧光分析法，即使用长效荧光标记物，在关闭激发光后再测定荧光强度的分析方法。镧系元素的荧光光谱有较大的Stokes位移，最大可达290nm，激发光谱和发射光谱间不会相互重叠，加上其发射的光谱信号峰很窄，荧光寿命长，铕的荧光寿命可达730μs，检测中只要在每个激发光脉冲过后采用延缓测量时间的方式，待短寿命的背景荧光衰变消失后，再打开取样门仪器记录长寿命铕鳌合物发射的特异性荧光，可以避免本底荧光干扰，提高检测的精密度。本专利技术所采用的技术方案为：本专利技术首先提供一种铁蛋白定量检测试剂盒，包括衬板，所述衬板的上表面依次搭接设置有样品垫、结合垫、NC膜以及吸收垫，所述NC膜上设置有检测线和质控线，所述NC膜的检测线处包被第二鼠抗铁蛋白单克隆抗体，所述NC膜的质控线包被羊抗鸡IgY多抗抗体；所述结合垫处设置有第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体标记的荧光微球和鸡IgY标记的荧光微球。相应的，本专利技术还提供了前述本专利技术的铁蛋白定量检测试剂盒的制备方法，该制备方法中“将各个预制好的部件按照结构要求组装在一起”的具体方式是本领域技术人员根据行业通用知识可以轻松实现的，并且该部分并不是本专利技术的创新点所在，因此不再详细赘述。本专利技术的制备方法中，结合垫以及NC膜的包被是至关重要的。结合垫中的所述第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体标记的荧光微球通过以下步骤制备：S1、取荧光微球并用硼酸缓冲液稀释，获得荧光微球稀释液；S2、向所得荧光微球稀释液内加入EDC溶液进行活化，获得荧光微球活化液；S3、将所得荧光微球活化液离心，去除上清液，取下层沉淀；S4、向下层沉淀内加入硼酸缓冲液进行复溶，然后加入第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体的稀释液，摇床反应，即得到第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体标记的荧光微球溶液。根据本专利技术的实施例，进一步的特征优化，结合垫中的所述第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体标记的荧光微球通过以下具体步骤制备实现：s1、取荧光微球并用50mmol/L的硼酸缓冲液稀释10倍，得到荧光微球稀释液；s2、每1000μL荧光微球稀释液内加入20～50μL的10mg/ml的EDC溶液，4℃条件下以80rpm/min旋转摇床，摇匀活化15min，获得荧光微球活化液；s3、将所得荧光微球活化液在4～10℃条件下，以14000rpm/min离心10min，去除上清液，取下层沉淀；s4、向下层沉淀内加入硼酸缓冲液进行复溶，然后加入第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体的稀释液得到标记反应体系，并使第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体在标记反应体系中的浓度为25μg/ml；将标记反应体系置于摇床，4℃条件下以80rpm/min摇匀1h，再继续摇床标记反应1h，即得到第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体标记的荧光微球溶液。结合垫中的所述鸡IgY标记的荧光微球通过以下步骤制备：P1、取荧光微球并用硼酸缓冲液稀释，获得荧光微球稀释液；P2、向所得荧光微球稀释液内加入EDC溶液进行活化，获得荧光微球活化液；P3、将所得荧光微球活化液离心，去除上清液，取下层沉淀；P4、向下层沉淀内加入硼酸缓冲液进行复溶，然后加入鸡IgY的稀释液，摇床反应，即得到鸡IgY标记的荧光微球溶液。根据本专利技术的实施例，进一步的特征优化，结合垫中的所述鸡IgY标记的荧光微球通过以下具体步骤制备实现：p1、取荧光微球并用50mmol/L的硼酸缓冲液稀释10倍，得到荧光微球稀释液；p2、每1000μL荧光微球稀释液内加入20～50μL的10mg/ml的EDC溶液，4℃条件下以80rpm/min旋转摇床，摇匀活化15min，获得荧光微球活化液；p3、将所得荧光微球活化液在4～10℃条件下，以14000rpm/min离心10min，去除上清液，取下层沉淀；p4、向下层沉淀内加入硼酸缓冲液进行复溶，然后加入鸡IgY的稀释液得到标记反应体系，并使鸡IgY在标记反应体系中的浓度为25μg/ml；将标记反应体系置于摇床，4℃条件下以80rpm/min摇匀1h，再继续摇床标记反应1h，即得到鸡IgY标记的荧光微球溶液。第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体标记的荧光微球和鸡IgY标记的荧光微球分别制备获取后，即可将两者混合用于结合垫的制备，具体过程步骤为：将所得第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体标记的荧光微球溶液和鸡IgY标记的荧光微球溶液混合得混合液，将混合液在乳胶垫上喷膜得到微球乳胶结合垫，将微球乳胶结合垫在37℃条件下烘干24h后即得所述结合垫。根据本专利技术的一个实施例，所述NC膜的制备方法为：向10mmol/L的PBS缓冲液中加入5wt％的蔗糖得到包被稀释液，使用所述包被稀释液分别稀释第二鼠抗铁蛋白单克隆抗体和羊抗鸡IgY多抗抗体得到第二鼠抗铁蛋白单克隆抗体稀释液和羊抗鸡IgY多抗抗体稀释液，然后使用第二鼠抗铁蛋白单克隆抗体稀释液和羊抗鸡IgY多抗抗体稀释液分别在硝酸纤维素膜上的T线和C线处划线，依次分别形成包被第二鼠抗铁蛋白单克隆抗体的检测线和包被羊抗鸡IgY多抗抗体的质控线，然后将硝酸纤维素膜在37℃条件下干燥4～6h即得所述NC膜。出于消除本底荧光，降低本底干扰的角度考虑，本专利技术还提供了前述本专利技术的铁蛋白定量检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：将待测样品置于样品垫，待测样品由样品垫向吸收垫层析，待测样品经过结合垫进入NC膜的检测线和质控线进行反应，反应结束后用本文档来自技高网...

【技术保护点】
铁蛋白定量检测试剂盒，包括衬板(5)，所述衬板(5)的上表面依次搭接设置有样品垫(1)、结合垫(2)、NC膜(3)以及吸收垫(4)，所述NC膜(3)上设置有检测线和质控线，其特征在于：所述NC膜(3)的检测线处包被第二鼠抗铁蛋白单克隆抗体，所述NC膜(3)的质控线包被羊抗鸡IgY多抗抗体；所述结合垫(2)处设置有第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体标记的荧光微球和鸡IgY标记的荧光微球。

【技术特征摘要】
1.铁蛋白定量检测试剂盒，包括衬板(5)，所述衬板(5)的上表面依次搭接设置有样品垫(1)、结合垫(2)、NC膜(3)以及吸收垫(4)，所述NC膜(3)上设置有检测线和质控线，其特征在于：所述NC膜(3)的检测线处包被第二鼠抗铁蛋白单克隆抗体，所述NC膜(3)的质控线包被羊抗鸡IgY多抗抗体；所述结合垫(2)处设置有第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体标记的荧光微球和鸡IgY标记的荧光微球。2.一种权利要求1所述的铁蛋白定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体标记的荧光微球通过以下步骤制备：S1、取荧光微球并用硼酸缓冲液稀释，获得荧光微球稀释液；S2、向所得荧光微球稀释液内加入EDC溶液进行活化，获得荧光微球活化液；S3、将所得荧光微球活化液离心，去除上清液，取下层沉淀；S4、向下层沉淀内加入硼酸缓冲液进行复溶，然后加入第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体的稀释液，摇床反应，即得到第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体标记的荧光微球溶液。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体标记的荧光微球具体制备步骤如下：s1、取荧光微球并用50mmol/L的硼酸缓冲液稀释10倍，得到荧光微球稀释液；s2、每1000μL荧光微球稀释液内加入20～50μL的10mg/ml的EDC溶液，4℃条件下以80rpm/min旋转摇床，摇匀活化15min，获得荧光微球活化液；s3、将所得荧光微球活化液在4～10℃条件下，以14000rpm/min离心10min，去除上清液，取下层沉淀；s4、向下层沉淀内加入硼酸缓冲液进行复溶，然后加入第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体的稀释液得到标记反应体系，并使第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体在标记反应体系中的浓度为25μg/ml；将标记反应体系置于摇床，4℃条件下以80rpm/min摇匀1h，再继续摇床标记反应1h，即得到第一鼠抗铁蛋白单克隆抗体标记的荧光微球溶液。4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述鸡IgY标记的荧光微球通过以下步骤制备：P1、取荧光微球并用硼酸缓冲液稀释，获得荧光微球稀释液；P2、向所得荧光微球稀释液内加入EDC溶液进行活化，获得荧光微球活化液；P3、将所得荧光微球活化液离心，去除上清液，取下层沉淀；P4、向下层沉淀内加入硼酸缓冲液进行复溶，然后加入...

【专利技术属性】
技术研发人员：张海峰，刘围，王春华，杨雯雯，马启冠，
申请(专利权)人：山东爱维德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37