一种检测NMP22的试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术系一种检测NMP22含量的试剂盒及其制备方法，利用管式吖啶酯标记的化学发光法，采用全自动化学发光免疫分析仪Caris200测定人尿液NMP22含量的检测，从而辅助膀胱癌早期诊断及预后监测等医疗需求。本发明专利技术试剂盒具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、操作简便及成本低廉等显著优点。

Reagent kit for detecting NMP22 and preparation method thereof

Kit and preparation method for detecting NMP22 content of this invention, the use of chemical tube labeled acridinium ester chemiluminescence detected by automated chemiluminescence immunoassay analyzer Caris200 determination of urine NMP22 content, to aid in early diagnosis and prognosis of bladder cancer and other medical needs. The kit has the advantages of high sensitivity, strong specificity, good stability, simple operation and low cost.

【技术实现步骤摘要】
一种检测NMP22的试剂盒及其制备方法
本专利技术是一种检测NMP22含量的试剂盒及其制备方法，涉及双抗体夹心吖啶酯标记管式化学发光免疫分析法(ChemiluminesentImmunoassay，CLIA)检测人尿液中NMP22浓度水平的试剂盒的制备工艺。
技术介绍
在泌尿系统肿瘤当中，膀胱癌的发病率高居首位，近年来膀胱癌的发病率有上升趋势。大部分膀胱癌患者确诊时处于分化良好或中等分化的非肌层浸润性膀胱癌，其中约10％的患者最终发展为肌层浸润性膀胱癌或转移性膀胱癌在保留膀胱的各种手术治疗中，约50％在2a内肿瘤可能复发，约10％-15％的复发肿瘤恶性程度有增加趋势，因此长期随访早期发现肿瘤复发是膀胱肿瘤治疗成功的关键之一。目前，寻找特异、敏感、稳定的早期诊断标志物，对膀胱癌的早期诊断治疗和预后判断起到了积极的作用。膀胱镜检查及活检是膀胱癌的诊断金标准，但属侵入性的检查，且有较高的经济成本，并存在尿路感染的风险。研究发现，膀胱癌患者细胞中核基质蛋白(nuclearmatrixprotein)浓度为正常细胞的25倍。NMP22在细胞凋亡后，由细胞核释出，以可溶性复合物或片段的形式存在于尿中，膀胱癌患者尿NMP22浓度水平为非癌对照组的20-80倍。临床工作中，NMP22肿瘤标记物在膀胱癌中的检测对膀胱癌的早期诊断治疗和预后判断起到了积极的作用。核基质蛋白构成了细胞核的内部结构框架，并与DNA复制、RNA合成、激素结合等功能有关。进一步的研究表明NMP22参与了基因表达的调节和协调。Fey和Penman的研究表明，NMP的表达存在细胞间差异。核有丝分裂器蛋白(NuMA)在核基质蛋白中占有很大的比例。它在分裂间期的细胞核内是分散的，在有丝分裂期位于纺锤体两极。核有丝分裂器蛋白最初由Lydersen和Pettijohn在分析染色质非组蛋白时首次报道22。随后，核分裂器蛋白的其他功能被提了出来，包括维持细胞核结构，建立/维持有丝分裂纺锤体和有丝分裂后细胞核的重建。在结构上，这一240KD的核有丝分裂器蛋白含有球形的头部和由中央螺旋竿分割开来的尾部结构域。核有丝分裂器蛋白的cDNA已被数个研究小组克隆并测序，虽然所报道的序列有所差异。在肿瘤细胞内，核有丝分裂器蛋白的升高与恶性细胞的细胞核结构/形态改变相符合。由于细胞死亡(如凋亡)，该蛋白从细胞内释放出来，并达到可检测的水平。利用识别核分裂器蛋白特定区域的单克隆抗体对尿液中由膀胱肿瘤细胞释出的核分裂器蛋白进行检测。尿核基质蛋白22(NMP22)检测试剂盒(胶体金法)试验所检测的核分裂器蛋白抗原部分被Matritech公司称为NMP22。目前市场中检测NMP22的方法有胶体金法。其中胶体金法，灵敏度较低，易出现假阳性，其结果易受主观因素的影响。本专利技术是采用化学发光免疫分析法检测NMP22含量。化学发光免疫测定(CLIA)技术是继酶免技术(EIA)、放免技术(RIA)、荧光免疫技术(FIA)和时间分辨荧光免疫技术(TRFIA)之后发展的一项新兴测定技术。根据发光物质(原理)的不同，可以分为直接化学发光免疫分析和化学发光酶免疫分析、以及电化学发光几大类型。其中直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体，而且采用纳米磁性微珠分离。如用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂(H2O2)和NaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光。CLIA特异性强、敏感性高，可检测到10-15mol/L的抗原量。快速，一般几十分钟或1～3小时内完成；操作简便，可进行固相和均相分析；试验重复性好，试剂易标准化和商品化，且不象放射分析那样存在强烈的环境污染和健康危害，是一种非常优秀的检测分析方法。目前已用于多种药物、激素、病原微生物及其代谢产物、抗体及其他生物活性物质的测定，并在临床尤其是大型医院有着较为广泛的应用。纳米磁性微珠分离是目前世界上最先进的分离手段，直接发光法不易受到检测样品中其他物质干扰，是目前世界技术最领先的发光模式。所以采用化学发光免疫分析法测定NMP22浓度。本专利技术利用单位及合作团队共同研制的具有自主知识产权的全自动化学发光免疫分析仪Caris200，测定NMP22含量的试剂盒，应用于人尿液NMP22含量的检测，从而辅助膀胱癌早期诊断及预后监测等医疗需求。本专利技术的试剂盒作为国内首个适用于Caris200的配套的测定NMP22的试剂盒，并利用管式吖啶酯标记的化学发光法，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、操作简便及成本低廉等显著优点。
技术实现思路
本专利技术采用于全自动化学发光免疫分析仪Caris200检测NMP22含量试剂盒(以下简称NMP22-CLIA试剂盒)。该试剂盒采用双抗体夹心免疫分析方法，利用化学发光磁性微球免疫技术，将抗-NMP22抗体-生物素-链霉亲和素的磁性微球和反应杯中的标准品/样本中的NMP22特异结合，然后再与吖啶酯盐标记的另一株抗-NMP22抗体反应形成免疫复合物，经预激发液(Pre-Trigger)和激发液(Trigger)的酸碱化学反应，即可测量化学发光反应的相对光单位(RLU/s)；标准品/样本中NMP22的含量和光学系统所测量出的相对光单位(RLU/s)成正比关系，通过标准曲线拟合，从而对可对尿液标本中NMP22含量进行定量测定。为了实现本专利技术，专利技术人采用了以下技术方案：1)筛选确认试剂反应实现所需的核心原料，过程包括以下步骤：①链霉亲和素与磁性微球偶联；②亲和素连接NMP22抗体；③以吖啶酯标记NMP22抗体；④配制与吖啶酯作用的发光底物液：预激发液和激发液；⑤配制NMP22抗体的校准品和质控品；⑥试剂盒的组装；2)试剂盒的性能评价，过程包括以下步骤：①反应体系的建立与优化：即绘制剂量-反应标准曲线并优化生物素标记抗体和吖啶酯标记抗体浓度；②实验室性能评估：即确定试剂盒的最低检测量、准确性、精密度和剂量-反应曲线的线性；③稳定性实验：即试剂盒在加速破坏实验中稳定性测试，确定试剂盒的储存条件；④cut-off值的建立：即通过临床样本的检测，设定试剂检测时的NMP22尿液正常参考值范围；⑤临床样本的检测：即检测试剂盒的特异性。本专利技术的试剂盒适用于全自动化学发光免疫分析仪Caris200。利用本专利技术的试剂盒进行检测，具有灵敏度高、特异性强、操作简单、检测范围宽(0～100IU/mL)，范围较广、无放射性污染的特点，非常适用于临床检测。附图说明图1NMP22-CLIA试剂盒检测剂量-反应标准曲线图。图2NMP22-CLIA试剂盒稳定性。图3NMP22-CLIA试剂盒反应线性及HOOK效应。图4NMP22-CLIA试剂盒检测健康者尿液浓度分布图(n＝425)。图5NMP22-CLIA试剂盒检测100例尿液样本的ROC曲线。具体实施方式实施例1链霉亲和素包被磁性微球的制备方法1、链霉的预处理：(1)将0.1mg链霉亲和素加入超滤离心管(10kDa)中，8000r/min离心5-6min。将离心浓缩后的链霉亲和素加入200uLBindingBuffe本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测NMP22的试剂盒及其制备方法，其特征在于试剂盒包括：M1试剂、R1试剂、R2试剂、预激发液、激发液、NMP22校准品、NMP22质控品，其中上述试剂分别由以下成分组成：1)M试剂：链霉亲和素包被的磁性微球，贮存于含有0.5％～3％明胶稳定剂的1％Mopso缓冲液和0.01％～0.08％ProClin300防腐剂中；2)R1试剂：生物素标记的Ms202抗体，贮存于含有0.5％～3％明胶稳定剂的1％Mopso缓冲液和0.01％～0.08％ProClin300防腐剂中；3)R2试剂：吖啶酯盐标记的Ms203抗体，贮存于含有0.5％～3％明胶稳定剂的1％Mopso缓冲液和0.01％～0.06％ProClin300防腐剂中；4)预激发液：0.1％～1％过氧化氢溶液、0.02％Tween‑20和0.05％TritonX‑100；5)激发液：pH为9～12的氢氧化钠溶液；6)NMP22校准品：由0IU/mL校准品1、5IU/mL校准品2、10IU/mL校准品3、20IU/mL校准品4、50IU/mL校准品5和100IU/mL校准品6组成，即6个浓度的NMP22抗原分别贮存于含有0.5％～3％明胶稳定剂的1％Mopso缓冲液和0.02％‑0.06％ProClin300防腐剂中；7)NMP22质控品：C1：2.5IU/mL，C2：25IU/mL，C3：80IU/mL，贮存于含有0.5％～3％明胶稳定剂的1％Mopso缓冲液和0.02％～0.06％ProClin300防腐剂中。...

【技术特征摘要】
1.一种检测NMP22的试剂盒及其制备方法，其特征在于试剂盒包括：M1试剂、R1试剂、R2试剂、预激发液、激发液、NMP22校准品、NMP22质控品，其中上述试剂分别由以下成分组成：1)M试剂：链霉亲和素包被的磁性微球，贮存于含有0.5％～3％明胶稳定剂的1％Mopso缓冲液和0.01％～0.08％ProClin300防腐剂中；2)R1试剂：生物素标记的Ms202抗体，贮存于含有0.5％～3％明胶稳定剂的1％Mopso缓冲液和0.01％～0.08％ProClin300防腐剂中；3)R2试剂：吖啶酯盐标记的Ms203抗体，贮存于含有0.5％～3％明胶稳定剂的1％Mopso缓冲液和0.01％～0.06％ProClin300防腐剂中；4)预激发液：0.1％～1％过氧化氢溶液、0.02％Tween-20和0.05％TritonX-100；5)激发液：pH为9～12的氢氧化钠溶液；6)NMP22校准品：由0IU/mL校准品1、5IU/mL校准品2、10IU/mL校准品3、20IU/mL校准品4、50IU/mL校准品5和100IU/mL校准品6组成，即6个浓度的NMP22抗原分别贮存于含有0.5％～3％明胶稳定剂的1％Mopso缓冲液和0.02％-0.06％Pr...

【专利技术属性】
技术研发人员：李明，吴英松，王红翠，董志宁，李志雄，邓传欢，
申请(专利权)人：广州市达瑞生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44