层粘连蛋白测试试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种层粘连蛋白测试试剂盒，包括：磁分离试剂，标记LN单克隆抗体的纳米磁性微球，浓度为167μg/ml；试剂R1，含有碱性磷酸酶标记的LN抗体，所述碱性磷酸酶标记的LN抗体浓度为1μg/ml；试剂R2，含有牛γ球蛋白质组分的缓冲液；标准品、质控品和校准品，含有LN抗原的牛血清白蛋白组分五(BSA V)溶液；清洗浓缩液，含有Tween‑20和Proclin‑300的缓冲液；稀释液，含有牛血清白蛋白组分五(BSA V)的溶液；发光底物，金刚烷的衍生物IUMIPHOS530。本发明专利技术提供的层粘连蛋白(LN)测试试剂盒，特异性强，灵敏度高，获得检测结果的时间短，操作方式简便，检测结果准确可靠。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫分析医学领域，尤其是涉及一种层粘连蛋白测试试剂盒及其制备方法。
技术介绍
层粘连蛋白(laminin,LN)主要存在于基膜(basallamina)结构中，是基膜所特有的非胶原糖蛋白,相对分子质量为820kDa,含13-15％的糖，有三个亚单位,即重链(α链,400kDa)和β1(215kDa)、β2(205kDa)两条轻链。结构上呈现不对称的十字形,由一条长臂和三条相似的短臂构成。这四个臂均有棒状节段和球状的末端域。β1和β2短臂上有两个球形结构域,α链上的短臂有三个球形结构域，其中有一个结构域同Ⅳ型胶原结合，第二个结构域同肝素结合，还有同细胞表面受体结合的结构域。正是这些独立的结合位点使LN作为一个桥梁分子，介导细胞同基膜结合。所以LN的主要功能就是作为基膜的主要结构成分对基膜的组装起关键作用,在细胞表面形成网络结构并将细胞固定在基膜上。LN还有许多其他的作用,如在细胞发育过程中刺激细胞粘着、细胞运动。LN还能够刺激胚胎中神经轴的生长,并促进成年动物的神经损伤后重生长和再生。如同纤粘连蛋白,细胞外的LN能够影响细胞的生长、迁移和分化。LN在原生殖细胞的迁移中起关键作用。肝纤维化时人层粘连蛋白与Ⅳ型胶原结合形成内皮基膜，导致纤维化。血清人层粘连蛋白测定是观察慢性肝炎患者肝组织纤维化程度的一项重要指标之一
技术实现思路
本专利技术提供了一种层粘连蛋白(LN)测试试剂盒及其制备方法，特异性强，灵敏度高，获得检测结果的时间短，操作方式简便，检测结果准确可靠。为了解决上述问题，本专利技术实施例公开了一种层粘连蛋白测试试剂盒，包括：磁分离试剂，标记LN单克隆抗体的纳米磁性微球，浓度为132～167μg/ml；试剂R1，含有碱性磷酸酶标记的LN抗体，所述碱性磷酸酶标记的LN抗体浓度为0.6～1μg/ml；试剂R2，含有牛γ球蛋白质组分的缓冲液；含有LN抗原的牛血清白蛋白组分五(BSAV)溶液的标准品、质控品和校准品；清洗浓缩液，含有Tween-20和Proclin-300的缓冲液稀释液，含有牛血清白蛋白组分五(BSAV)的溶液；发光底物，金刚烷的衍生物IUMIPHOS530，所述金刚烷的衍生物IUMIPHOS530的浓度为10μg/ml。优选地，各试剂体积比为：磁分离试剂4-6，试剂R14-6，试剂R24-6，标准品4-6，质控品1-3，校准品1-3，清洗浓缩液20-30，稀释液10-20，发光底物25-40。一种层粘连蛋白测试试剂盒的制备方法，包括如下步骤：(1)磁分离试剂的制备配制磁珠缓冲液：分别称取Tris、NaCl于容器中，配制Tween-20溶液，倒入所述容器中；量取Proclin-300，溶解于水中后倒入所述容器中，在所述容器中加入水，并充分搅拌，使加入的试剂完全溶解；调节PH值在7.95－8.05范围内；称取BSAV(牛血清白蛋白组分五)倒入所述容器中；定容，配制溶液中Tris浓度为4.58g/L，NaCl浓度为6.81g/L,Tween-20浓度为0.96g/L，浓度0.02％的Proclin-300，BSAV浓度为3g/L，PH值在7.95－8.05范围内，配制好的溶液用0.2μm滤器过滤，过滤后在于2-8℃下保存；配制磁分离试剂：将DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺)溶于DMSO中，配制成浓度为20mg/mL的溶液；取抗体溶于PH9.5的0.1mol/LPB缓冲液中，浓度为2mg/mL；将DSS溶液加入到抗体溶液中，室温放置90分钟；离心处理；另取浓度为100mg/ml的磁珠，按与抗体溶液的体积比为1:2量取，加入反应杯中，经磁铁吸附2分钟后吸取上清；用PH9.5、0.1mol/L的PB清洗磁珠；将离心处理后的浓缩抗体溶液加入到清洗后的磁珠中混匀，室温放置4小时，保持混匀状态；磁珠-抗体混合液中加入1mol/L的Tris溶液，37℃下放置15分钟，所述Tris的加样量为1mg抗体加0.15mlTris；用PH7.2、0.1mol/L的PB清洗已经标记好抗体的磁珠；用磁珠保存液稀释并制得浓度为0.05％的LN磁分离试剂；再将制得的LN磁分离试剂与制得的磁珠缓冲液按照1：1的比例混匀得磁分离试剂；(2)试剂R1的制备试剂R1稀释液的配制：量取Tris、NaCl、Zncl2、Proclin-300、MgCl2于容器中，加入水，充分搅拌，使加入的试剂完全溶解；调节PH在7.35-7.45范围内；加入BSAV；定容，配制溶液中Tris浓度为6.06g/L，NaCl浓度为13g/L,Zncl2的浓度为0.05g/L，Proclin-300的浓度0.02％，MgCl2的浓度为0.05g/L，BSAV浓度为3g/L，PH在7.35-7.45范围内，配制好的溶液用0.2μm滤器过滤，过滤后在于2-8℃下保存；配制试剂R1，称取碱性磷酸酶(ALP)溶于生理盐水中，离心浓缩处理；与离心浓缩后的ALP浓缩液中按体积比5:1加入浓度为0.1M的NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟；将搅拌后ALP溶液透析处理；透析处理后的ALP溶液中加入浓度为0.2M、PH9.5的碳酸盐缓冲液，使醛化ALP的PH升高到9.0～9.5，立即加入IgG抗体，加入抗体的量按与ALP的重量比为1:10加入，在浓度为0.01M的碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时；加入浓度为4mg/ml的NaBH4溶液混匀，置于4℃下2小时；透析处理；之后在搅拌下逐滴加入等体积的饱和硫酸铵，置于4℃下1小时；离心处理弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵清洗，将沉淀物溶于浓度为0.15M、PH7.4的PBS溶液中；透析处理，去除铵离子；离心处理去除沉淀，上清液为酶结合物，与制得的酶反应物稀释液以1：600的体积比混合均匀，即的试剂R1；(3)试剂R2的制备称取Tris、NaCl于容器中，量取Proclin-300，用水溶解后加入到所述容器中；在所述容器中加水，搅拌，使得加入到所述容器中的试剂完全溶解，调节PH在7.35-7.45的范围内；称取牛γ球蛋白(IgG)，加入到所述容器中；定容，配制溶液中，Tris浓度为1.56g/L,NaCl浓度为4.23g/L,Proclin-300的浓度0.02％，牛γ球蛋白(IgG)的浓度为0.9g/L,PH在7.35-7.45的范围内，配制好的溶液用0.2μm滤器过滤，过滤后在于2-8℃下保存；(4)标准品、质控品及校准品的配制LN标准品配制浓度为30，90，180，450，900ng/ml；质控品配制浓度点为60，450ng/ml；校准品配制浓度为90,450ng/ml；(5)清洗浓缩液的配制称取Tris和NaCl于容器中，称取Tween-20于水中溶解后将溶液加入到所述容器中；量取Proclin-300于水中溶解后将溶液加入到所述容器中；向所述容器中加入水，充分搅拌，使所加入的试剂完全溶解；调节PH在7.35－7.45范围内；定容，配制溶液中Tris浓度为12.54g/L，NaCl浓度为325.6g/L，Tween-20浓度为5g/L，Proclin-300的浓度0.02％，PH在7.35-7.45的范围内，配制好的溶液用0.2μm滤器过滤，过滤后在于2-8℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种层粘连蛋白测试试剂盒，其特征在于，包括：磁分离试剂，标记LN单克隆抗体的纳米磁性微球，浓度为132～167μg/ml；试剂R1，含有碱性磷酸酶标记的LN抗体，所述碱性磷酸酶标记的LN抗体浓度为0.6～1μg/ml；试剂R2，含有牛γ球蛋白质组分的缓冲液；含有LN抗原的牛血清白蛋白组分五(BSA V)溶液的标准品、质控品和校准品；清洗浓缩液，含有Tween‑20和Proclin‑300的缓冲液稀释液，含有牛血清白蛋白组分五(BSA V)的溶液；发光底物，金刚烷的衍生物IUMIPHOS530，所述金刚烷的衍生物IUMIPHOS530的浓度为10μg/ml。

【技术特征摘要】
1.一种层粘连蛋白测试试剂盒，其特征在于，包括：磁分离试剂，标记LN单克隆抗体的纳米磁性微球，浓度为132～167μg/ml；试剂R1，含有碱性磷酸酶标记的LN抗体，所述碱性磷酸酶标记的LN抗体浓度为0.6～1μg/ml；试剂R2，含有牛γ球蛋白质组分的缓冲液；含有LN抗原的牛血清白蛋白组分五(BSAV)溶液的标准品、质控品和校准品；清洗浓缩液，含有Tween-20和Proclin-300的缓冲液稀释液，含有牛血清白蛋白组分五(BSAV)的溶液；发光底物，金刚烷的衍生物IUMIPHOS530，所述金刚烷的衍生物IUMIPHOS530的浓度为10μg/ml。2.根据权利要求1所述的层粘连蛋白测试试剂盒，其特征在于，各试剂体积比为：磁分离试剂4-6，试剂R14-6，试剂R24-6，标准品4-6，质控品1-3，校准品1-3，清洗浓缩液20-30，稀释液10-20，发光底物25-40。3.如权利要求1或2所述的层粘连蛋白测试试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)磁分离试剂的制备配制磁珠缓冲液：分别称取Tris、NaCl于容器中，配制Tween-20溶液，倒入所述容器中；量取Proclin-300，溶解于水中后倒入所述容器中，在所述容器中加入水，并充分搅拌，使加入的试剂完全溶解；调节PH值在7.95－8.05范围内；称取BSAV(牛血清白蛋白组分五)倒入所述容器中；定容，配制溶液中Tris浓度为4.58g/L，NaCl浓度为6.81g/L,Tween-20浓度为0.96g/L，浓度0.02％的Proclin-300，BSAV浓度为3g/L，PH值在7.95－8.05范围内，配制好的溶液用0.2μm滤器过滤，过滤后在于2-8℃下保存；配制磁分离试剂：将DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺)溶于DMSO中，配制成浓度为20mg/mL的溶液；取抗体溶于PH9.5的0.1mol/LPB缓冲液中，浓度为2mg/mL；将DSS溶液加入到抗体溶液中，室温放置90分钟；离心处理；另取浓度为100mg/ml的磁珠，按与抗体溶液的体积比为1:2量取，加入反应杯中，经磁铁吸附2分钟后吸取上清；用PH9.5、0.1mol/L的PB清洗磁珠；将离心处理后的浓缩抗体溶液加入到清洗后的磁珠中混匀，室温放置4小时，保持混匀状态；磁珠-抗体混合液中加入1mol/L的Tris溶液，37℃下放置15分钟，所述Tris的加样量为1mg抗体加0.15mlTris；用PH7.2、0.1mol/L的PB清洗已经标记好抗体的磁珠；用磁珠保存液稀释并制得浓度为0.05％的LN磁分离试剂；再将制得的LN磁分离试剂与制得的磁珠缓冲液按照1：1的比例混匀得磁分离试剂；(2)试剂R1的制备试剂R1稀释液的配制：量取Tris、NaCl、Zncl2、Proclin-300、MgCl2于容器中，加入水，充分搅拌，使加入的试剂完全溶解；调节PH在7.35-7.45范围内；加入BSAV；定容，配制溶液中Tris浓度为6.06g/L，NaCl浓度为13g/L,Zncl2的浓度为0.05g/L，Proclin-300的浓度0.02％，MgCl2的浓度为0.05g/L，BSAV浓度为3g/L，PH在7.35-7.45范围内，配制好的溶液用0.2μm滤器过滤，过滤后在于2-8℃下保存；配制试剂R1，称取碱性磷酸酶(ALP)溶于生理盐水中，离心浓缩处理；与离心浓缩后的ALP浓缩液中按体积比5:1加入浓度为0.1M的NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟；将搅拌后ALP溶液透析处理；透析处理后的ALP溶液中加入浓度为0.2M、PH9.5的碳酸盐缓冲液，使醛化ALP的PH升高到9.0～9.5，立即加入IgG抗体，加入抗体的量按与ALP的重量比为1:10加入，在浓度为0.01M的碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时；加入浓度为4mg/ml的NaBH4溶液混匀，置于4℃下2小时；透析处理；之后在搅拌下逐滴加入等体积的饱和硫酸铵，置于4℃下1小时；离心处理弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵清洗，将沉淀物溶于...

【专利技术属性】
技术研发人员：王键，
申请(专利权)人：王键，
类型：发明
国别省市：北京;11