肽片段的制备方法及该方法中使用的肽片段制备用试剂盒、以及分析方法技术

本发明专利技术涉及一种使用蛋白酶切断蛋白质从而制备肽片段的方法。本发明专利技术的方法具有如下步骤：使在细孔(29)内固定化有切断对象的基质蛋白(25)的多孔质体(20)与在表面固定化有蛋白酶(15)的微粒(10)在液体中接触。本发明专利技术中，前述微粒(10)的平均粒径大于前述多孔体(20)的平均孔径。根据本发明专利技术的方法，能够位置选择性地切断抗体的基质蛋白(25)。利用质谱法对通过上述方法得到的肽片段等进行分析，从而可以进行抗体的蛋白质的检测、定量分析。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及使用蛋白酶位置选择性地切断抗体等蛋白质从而制备肽片段的方法、及该方法中使用的肽片段制备用试剂盒。进而，本专利技术涉及对利用该方法制备的肽片段利用质谱法等进行分析从而进行蛋白质的检测、定量的分析方法。
技术介绍
抗体药物的需求正迅速扩大，在临床现场，对血液中的抗体浓度进行简便地定量的重要性在提高。一直以来，虽然并未重视正确测定给与抗体药物后的血药浓度，但伴随曲妥珠单抗(商品名：Herceptin)在胃癌应用扩大的临床试验中，发现其血药浓度与生存期之间存在显著性差异之后，在抗体药物的临床试验等中，测定抗体的血药浓度也正成为必须的。例如，在确认药代动力学等质量管理、确认仿制药在临床试验等中与原药的等效性等方面也要求进行抗体药物的鉴定、其血药浓度的定量。使用了抗原抗体反应的ELISA(酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay))法的特异性和定量性优异，所以在临床试验等中广泛用于血液中的抗原、抗体的检测/定量等。然而，ELISA法是以单一的蛋白质(抗原或抗体)的检测为目的的方法，不能同时检测多种不同的蛋白质。为了利用ELISA法检测多种蛋白质，需要针对每一个检测对象制作特异性抗体并设定浓度测定条件，需要巨大的精力和费用。另外，由于ELISA法利用抗原抗体反应，所以已知下述问题：联合用药、与代谢物的交叉反应可能影响测定结果，一部分的抗体药物难以用于保存被检体等。因此，期待开发出能够普遍适用于各种抗体的分析方法。伴随蛋白质组学的发展，开发了利用质谱法可对蛋白质网罗性地检测/定量的技术，近年来，也可进行抗体等巨大生物体分子的解析。对于质谱，需要对测定对象分子进行离子化，通常难以直接用质谱对抗体等巨大生物体分子进行分析。因此，采用了如下方法：利用蛋白酶消化来切断蛋白质(片段化)，从经片段化的肽中选择针对分析对象的蛋白质具有特异性的氨基酸序列的肽片段，利用质谱装置进行检测/定量的方法。通常，为了提高利用蛋白酶的消化效率，在使基质蛋白在高浓度的尿素、胍溶液中变性之后，进行蛋白酶消化。在利用蛋白酶消化对抗体等蛋白质进行片段化并进行质量分析时，选择性地检测出作为检测对象的肽片段是很重要的。然而，有时会难以从含有多种多样的夹杂物的生物体试样中检测出源自分析对象的蛋白质的特定肽片段。即，由于血液等生物体试样含有多种多样的夹杂物，所以在生物体试样中添加蛋白酶时，源自夹杂物的蛋白质也会被蛋白酶消化，从而生成数量庞大的肽片段。为了从中选择性地检测/定量源自检测对象(例如特定的抗体)的目标肽片段，在供于质谱之前，需要对肽片段进行分离、浓缩等操作。另外，如果由检测对象之外的蛋白质产生具有与检测对象的蛋白质的肽片段相同的氨基酸序列的肽片段，则会成为误检、定量性降低的原因。因此，存在伴随由生物体试样产生的肽片段数的增加而作为检测对象的肽片段的选择变得更加困难的倾向。鉴于这样的生物体试样的复杂性，开发出了如下的方法：在利用液相色谱(LC)纯化试样之后，供于质谱装置的方法；通过利用碰撞诱导解离(CID)等产生离子断裂的多级的质谱、或它们的组合(多反应监测，MRM)，从而对生物体试样等复杂试样中的特定的蛋白质进行定量的方法。然而，存在如下问题：试样变得越复杂，越需要组合各种各样的分离模式、越需要高精度的实验装置，或分析条件的设定越需要花费大量的时间。另外，即使在使用了纯化后的试样的情况下，抗体等大蛋白也因蛋白酶消化而产生多种肽片段，因此，存在从中选择性地检测/定量针对检测对象具有特有的氨基酸序列的肽片段变得困难的倾向。鉴于这样的问题，开发出了：针对分析对象的蛋白质进行位置选择性地蛋白酶消化，使试样中的肽片段的数量(种类)减少，提高分析精度且简化分析的方法。例如，专利文献1中提出了如下方法：在利用抗体的胃蛋白酶消化产生F(ab’)2片段之后，进而用胰蛋白酶等蛋白酶消化F(ab’)2片段，产生含有抗体的互补性决定区(CDR)的肽片段，利用质谱对含有CDR的肽片段进行检测/定量。在此对抗体的结构进行说明。所有的抗体具有2条重链(H链)和2条轻链(L链)。1条轻链和1条重链通过二硫键连接而形成异二聚体，进而2个异二聚体通过2个二硫(S-S)键连接而形成“Y”字型的异四聚体(参照图2)。抗体具有由重链形成的1个Fc(Fragment,crystallizable)结构域和由重链和轻链形成的2个Fab(Fragment,antigenbinding)结构域，Fc结构域和Fab结构域借助铰链部连接。抗体的Fc结构域主要承担引起抗体与抗原结合之后的反应的功能(效应子功能)，对于源自相同种类的抗体的大部分，Fc结构域的氨基酸序列是相同的。另一方面，Fab结构域的前端部分(N末端)具有与抗原结合的功能。Fab结构域之中，为了使N末端的部分能够结合于多种抗原，在氨基酸序列上可见各种变化。该区域称为可变区(V区)，轻链的可变区称为VL区，重链的可变区称为VH区。V区之外的Fab结构域和Fc结构域是氨基酸序列变化少的区域，称为恒定区(C区)。轻链的恒定区称为CL区，重链的恒定区称为CH区。CH区进一步分为CH1区、CH2区和CH3区这3个区。重链的Fab结构域包含VH区和CH1区，重链的Fc结构域包含CH2和CH3。铰链部位于CH1和CH2之间。抗体的特异性(即与抗原的特异性结合性)是由V区的氨基酸序列的组合所决定的。轻链和重链分别在Fab结构域的V区内具有3个互补性决定区(CDR)。CDR也称为高变区，根据抗体种类不同则氨基酸序列不同。由于抗体在轻链和重链上分别具有3个CDR(总计6种CDR)，因而产生能够与各种各样的抗原结合的多样性。换言之，CDR是表征抗体的区域，通过特定抗体的CDR的氨基酸序列能够对抗体进行鉴定。如上所述，抗体的Fab结构域和Fc结构域借助铰链部连接。由于作为蛋白酶之一的木瓜蛋白酶切断该铰链部，所以通过抗体的木瓜蛋白酶消化而产生2个Fab结构域和1个Fc结构域。另外，作为蛋白酶之一的胃蛋白酶切断铰链部的2根二硫键的Fc结构域侧(C末端侧)，所以通过胃蛋白酶消化产生2个Fab结构域键合的F(ab’)2结构域和多个Fc结构域片段。上述专利文献1的方法中利用胃蛋白酶消化或木瓜蛋白酶消化产生Fab结构域或F(ab’)2结构域，对Fab结构域或F(ab’)2结构域位置选择性地进行蛋白酶消化。利用该方法能降低利用蛋白酶消本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肽片段的制备方法，其特征在于，具有如下步骤：基质固定步骤，在多孔体的细孔内固定化切断对象的基质蛋白；和消化步骤，使固定化有基质蛋白的所述多孔体与在表面固定化有蛋白酶的微粒在液体中接触，进行所述基质蛋白的蛋白酶消化，所述微粒的平均粒径大于所述多孔体的平均孔径。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种肽片段的制备方法，其特征在于，具有如下步骤：
基质固定步骤，在多孔体的细孔内固定化切断对象的基质蛋白；和
消化步骤，使固定化有基质蛋白的所述多孔体与在表面固定化有蛋白酶
的微粒在液体中接触，进行所述基质蛋白的蛋白酶消化，
所述微粒的平均粒径大于所述多孔体的平均孔径。
2.根据权利要求1所述的肽片段的制备方法，其中，在所述基质固定步
骤中，所述基质蛋白的规定区域被固定化于所述多孔体上，与所述规定区域
不同的区域位置选择性地被蛋白酶消化。
3.根据权利要求1或2所述的肽片段的制备方法，其中，在所述多孔体的
细孔内固定化有与所述基质蛋白进行位点特异性地相互作用的接头分子，
在所述基质固定步骤中，所述基质蛋白借助所述接头分子固定化在所述
多孔体的细孔内。
4.根据权利要求3所述的肽片段的制备方法，其中，在所述基质固定步
骤后，所述接头分子与所述基质蛋白结合后的状态的分子大小为所述多孔体
的孔径的0.5倍～1.5倍。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的肽片段的制备方法，其中，所述微
粒的表面被能够与所述蛋白酶结合的间隔分子修饰，所述蛋白酶借助所述间
隔分子固定化在所述微粒的表面。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的肽片段的制备方法，其中，所述基
质...

【专利技术属性】
技术研发人员：岛田崇史，深尾典子，青木智景，佐藤孝明，
申请(专利权)人：株式会社岛津制作所，
类型：发明
国别省市：日本;JP