透明质酸（HA）测试试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种透明质酸测试试剂盒，包括：磁分离试剂，标记HABP蛋白(透明质酸结合蛋白)的纳米磁性微球，浓度为167μg/ml；试剂R1，含有碱性磷酸酶标记的aggrecan蛋白，所述碱性磷酸酶标记的aggrecan蛋白浓度为1μg/ml；试剂R2，含有牛γ球蛋白质组分的缓冲液；含有HA抗原的牛血清白蛋白组分五(BSA V)溶液的标准品、质控品和校准品；清洗浓缩液，含有Tween‑20和Proclin‑300的缓冲液；稀释液，含有牛血清白蛋白组分五(BSA V)的溶液；发光底物，金刚烷的衍生物IUMIPHOS530。本发明专利技术提供的透明质酸(HA)测试试剂盒及其制备方法，特异性强，灵敏度高，获得检测结果的时间短，操作方式简便，检测结果准确可靠。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫分析医学领域，尤其是涉及一种透明质酸(HA)测试试剂盒及其制备方法。
技术介绍
透明质酸(hyaluronicacid，HA)是一种大分子葡萄氨基多糖，分子量为4000万～8000万，主要由间质细胞合成。HA主要存在于结缔组织、皮肤、关节液、软骨及玻璃体液等处。构成该部位的组织基质。血清HA水平主要反映肝脏内皮细胞功能及受损程度，反映活动性纤维化，预测肝硬化等疾病的良好指标。如肝硬化，病程长，肝组织纤维化变性程度严重，血清HA水平明显增高，甚至达1000μg/L以上，主要因为肝硬化时门-腔静脉分流，携HA的体循环血进入肝脏分解代谢减少；肝组织受损，肝内皮细胞数量减少，代谢功能降低。肝硬化时HA增高水平与肝组织病理改变程度有密切关系；HA水平达250μg/L，可判定为肝硬化。慢性活动性肝炎和慢性迁延性肝炎，血清HA水平亦有较明显改变，前者高于后者，其水平亦与肝细胞损害和肝纤维化活动程度有关；HA水平达165μg/L，可作为慢性活动性肝炎和慢性迁延性肝炎的分界。急性肝炎，由于肝细胞受损，坏死物质间接刺激肝脏间质细胞合成HA增多，血清HA水平可有轻度升高。对肝病患者而言，HA总体水平依据病损和病理改变程度表现为：肝硬化＞慢性活动性肝炎＞慢性迁延性肝炎＞急性肝炎。可见HA做为反映肝细胞纤维化损害的指标，优于ALT。因为ALT在肝细胞停止破坏，肝内纤维化，肝硬化时反而不见升高。对于肝癌，HA亦可有明显增高。对于肺癌，由于癌浸润组织及周围结缔组织释放HA及透明质酸酶抑制物增加，特别是肺间皮细胞癌，血清HA水平可明显升高，同时肺泡灌洗液HA(即BAL-HA)水平增高远远超过血清HA(S-HA)水平，如果BAL-HA/S-HA比值明显增高，则对肺部恶性肿瘤的诊断有一定参考价值。慢性肾炎及慢性肾功能不全，血清HA水平明显高于正常对照组，并与肌酐、尿素氮呈正相关。肾病时血清HA可反映肾功能的损害程度。这与血中有毒代谢物聚集刺激组织间质细胞合成HA增多有关。而肾透析前后HA水平没有明显变化，由于HA是一种大分子物质，而透析用透膜只能滤过分子量小于35000的物质，故透析法不能把HA清除；HA作为肾脏功能损害的一项指标，反映肾损害的程度有一定参考价值。
技术实现思路
本专利技术提供了一种透明质酸(HA)测试试剂盒及其制备方法，特异性强，灵敏度高，获得检测结果的时间短，操作方式简便，检测结果准确可靠。为了解决上述问题，本专利技术实施例公开了一种透明质酸测试试剂盒，包括：磁分离试剂，标记HABP蛋白的纳米磁性微球，浓度为167μg/ml；试剂R1，含有碱性磷酸酶标记的aggrecan蛋白，所述碱性磷酸酶标记的aggrecan蛋白浓度为1μg/ml；试剂R2，含有牛γ球蛋白质组分的缓冲液；含有HA抗原的牛血清白蛋白组分五(BSAV)溶液的标准品、质控品和校准品；清洗浓缩液，含有Tween-20和Proclin-300的缓冲液；稀释液，含有牛血清白蛋白组分五(BSAV)的溶液；发光底物，金刚烷的衍生物IUMIPHOS530，所述金刚烷的衍生物IUMIPHOS530的浓度为10μg/ml。优选地，各试剂体积比为：磁分离试剂4-6，试剂R14-6，试剂R24-6，标准品4-6，质控品1-3，校准品1-3，清洗浓缩液20-30，稀释液10-20，发光底物25-40。一种透明质酸测试试剂盒的制备方法，包括如下步骤：(1)磁分离试剂的制备配制磁珠缓冲液：分别称取Tris、NaCl于容器中，配制Tween-20溶液，倒入所述容器中；量取Proclin-300，溶解于水中后倒入所述容器中，在所述容器中加入水，并充分搅拌，使加入的试剂完全溶解；调节PH值在7.95～8.05范围内；称取BSAV(牛血清白蛋白组分五)倒入所述容器中；定容，配制溶液中Tris浓度为4.58g/L，NaCl浓度为6.81g/L,Tween-20浓度为0.96g/L，浓度0.02％的Proclin-300，BSAV浓度为3g/L，PH值在7.95～8.05范围内，配制好的溶液用0.2μm滤器过滤，过滤后在于2～8℃下保存；配制磁分离试剂：将DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺)溶于DMSO中，配制成浓度为20mg/mL的溶液；取HABP蛋白溶于PH9.5的0.1mol/LPB缓冲液中，浓度为2mg/mL；将DSS溶液加入到HABP蛋白溶液中，室温放置90分钟；离心处理；另取浓度为100mg/ml的磁珠，按与HABP蛋白溶液的体积比为1:2量取，加入反应杯中，经磁铁吸附2分钟后吸取上清液；用PH9.5、0.1mol/L的PB清洗磁珠；将离心处理后的浓缩HABP蛋白溶液加入到清洗后的磁珠中混匀，室温放置4小时，保持混匀状态；磁珠-HABP蛋白混合液中加入1mol/L的Tris溶液，37℃下放置15分钟，所述Tris的加样量为1mgHABP蛋白加0.15mlTris；用PH7.2、0.1mol/L的PB清洗已经标记好HABP蛋白的磁珠；用磁珠保存液稀释并制得浓度为0.05％的HA磁分离试剂；再将制得的HA磁分离试剂与制得的磁珠缓冲液按照1：1的比例混匀得磁分离试剂；(2)试剂R1的制备试剂R1稀释液的配制：量取Tris、NaCl、Zncl2、Proclin-300、MgCl2于容器中，加入水，充分搅拌，使加入的试剂完全溶解；调节PH在7.35～7.45范围内；加入BSAV；定容，配制溶液中Tris浓度为6.06g/L，NaCl浓度为13g/L,Zncl2的浓度为0.05g/L，Proclin-300的浓度0.02％，MgCl2的浓度为0.05g/L，BSAV浓度为3g/L，PH在7.35～7.45范围内，配制好的溶液用0.2μm滤器过滤，过滤后在于2～8℃下保存；配制试剂R1，称取1mg碱性磷酸酶(ALP)溶于生理盐水中，离心浓缩处理；与离心浓缩后的ALP浓缩液按体积比5:1加入浓度为0.1M的NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟；将搅拌后ALP溶液透析处理；透析处理后的ALP溶液中加入浓度为0.2M、PH9.5的碳酸盐缓冲液，使醛化ALP的PH升高到9.0～9.5，立即加入aggrecan蛋白，加入aggrecan蛋白的量按与ALP的重量比为1:10加入，在浓度为0.01M的碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时；加入浓度为4mg/ml的NaBH4溶液混匀，置于4℃下2小时；透析处理；之后在搅拌下逐滴加入等体积的饱和硫酸铵，置于4℃下1小时；离心处理弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵清洗，将沉淀物溶于浓度为0.15M、PH7.4的PBS溶液中；透析处理，去除铵离子；离心处理去除沉淀，上清液为酶结合物，按与1MMgcl2溶液100:1的体积比加入1MMgcl2溶液，与制得的酶反应物稀释液以1：100的体积比混合均匀，即的试剂R1；(3)试剂R2的制备称取Tris、NaCl于容器中，量取Proclin-300，用水溶解后加入到所述容器中；在所述容器中加水，搅拌，使得加入到所述容器中的试剂完全溶解，调节PH在7.35～7.45的范围内；称取牛γ球蛋白(IgG)，加入到所述容器中；定容，配制溶液中，Tris浓度为1.56g/L,Na本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种透明质酸测试试剂盒，其特征在于，包括：磁分离试剂，标记HABP蛋白的纳米磁性微球，浓度为167μg/ml；试剂R1，含有碱性磷酸酶标记的aggrecan蛋白，所述碱性磷酸酶标记的aggrecan蛋白浓度为1μg/ml；试剂R2，含有牛γ球蛋白质组分的缓冲液；含有HA抗原的牛血清白蛋白组分五(BSA V)溶液的标准品、质控品和校准品；清洗浓缩液，含有Tween‑20和Proclin‑300的缓冲液；稀释液，含有牛血清白蛋白组分五(BSA V)的溶液；发光底物，金刚烷的衍生物IUMIPHOS530，所述金刚烷的衍生物IUMIPHOS530的浓度为10μg/ml。

【技术特征摘要】
1.一种透明质酸测试试剂盒，其特征在于，包括：磁分离试剂，标记HABP蛋白的纳米磁性微球，浓度为167μg/ml；试剂R1，含有碱性磷酸酶标记的aggrecan蛋白，所述碱性磷酸酶标记的aggrecan蛋白浓度为1μg/ml；试剂R2，含有牛γ球蛋白质组分的缓冲液；含有HA抗原的牛血清白蛋白组分五(BSAV)溶液的标准品、质控品和校准品；清洗浓缩液，含有Tween-20和Proclin-300的缓冲液；稀释液，含有牛血清白蛋白组分五(BSAV)的溶液；发光底物，金刚烷的衍生物IUMIPHOS530，所述金刚烷的衍生物IUMIPHOS530的浓度为10μg/ml。2.根据权利要求1所述的透明质酸测试试剂盒，其特征在于，各试剂体积比为：磁分离试剂4-6，试剂R14-6，试剂R24-6，标准品4-6，质控品1-3，校准品1-3，清洗浓缩液20-30，稀释液10-20，发光底物25-40。3.如权利要求1或2所述的透明质酸测试试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)磁分离试剂的制备配制磁珠缓冲液：分别称取Tris、NaCl于容器中，配制Tween-20溶液，倒入所述容器中；量取Proclin-300，溶解于水中后倒入所述容器中，在所述容器中加入水，并充分搅拌，使加入的试剂完全溶解；调节PH值在7.95～8.05范围内；称取BSAV(牛血清白蛋白组分五)倒入所述容器中；定容，配制溶液中Tris浓度为4.58g/L，NaCl浓度为6.81g/L,Tween-20浓度为0.96g/L，浓度0.02％的Proclin-300，BSAV浓度为3g/L，PH值在7.95～8.05范围内，配制好的溶液用0.2μm滤器过滤，过滤后在于2～8℃下保存；配制磁分离试剂：将DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺)溶于DMSO中，配制成浓度为20mg/mL的溶液；取HABP蛋白溶于PH9.5的0.1mol/LPB缓冲液中，浓度为2mg/mL；将DSS溶液加入到HABP蛋白溶液中，室温放置90分钟；离心处理；另取浓度为100mg/ml的磁珠，按与HABP蛋白溶液的体积比为1:2量取，加入反应杯中，经磁铁吸附2分钟后吸取上清液；用PH9.5、0.1mol/L的PB清洗磁珠；将离心处理后的浓缩HABP蛋白溶液加入到清洗后的磁珠中混匀，室温放置4小时，保持混匀状态；磁珠-HABP蛋白混合液中加入1mol/L的Tris溶液，37℃下放置15分钟，所述Tris的加样量为1mgHABP蛋白加0.15mlTris；用PH7.2、0.1mol/L的PB清洗已经标记好HABP蛋白的磁珠；用磁珠保存液稀释并制得浓度为0.05％的HA磁分离试剂；再将制得的HA磁分离试剂与制得的磁珠缓冲液按照1：1的比例混匀得磁分离试剂；(2)试剂R1的制备试剂R1稀释液的配制：量取Tris、NaCl、Zncl2、Proclin-300、MgCl2于容器中，加入水，充分搅拌，使加入的试剂完全溶解；调节PH在7.35～7.45范围内；加入BSAV；定容，配制溶液中Tris浓度为6.06g/L，NaCl浓度为13g/L,Zncl2的浓度为0.05g/L，Proclin-300的浓度0.02％，MgCl2的浓度为0.05g/L，BSAV浓度为3g/L，PH在7.35～7.45范围内，配制好的溶液用0.2μm滤器过滤，过滤后在于2～8℃下保存；配制试剂R1，称取1mg碱性磷酸酶(ALP)溶于生理盐水中，离心浓缩处理；与离心浓缩后的ALP浓缩液按体积比5:1加入浓度为0.1M的NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟；将搅拌后ALP溶液透析处理；透析处理后的ALP溶液中加入浓度为0.2M、PH9.5的碳酸盐缓冲液，使醛化ALP的PH升高到9.0～9.5，立即加入aggrecan蛋白，加入aggrecan蛋白的量按与ALP的重量比为1:10加入，在浓度为0.01M的碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时；加入浓度为4mg/ml的NaBH4溶液混匀，置于4℃下2小时；透析处理；之后在搅拌下逐滴加入等体积的饱和硫酸铵，置于4℃下1小时；离心处理弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵清洗，将沉淀物溶于浓...

【专利技术属性】
技术研发人员：王键，
申请(专利权)人：王键，
类型：发明
国别省市：北京;11