一种MALDI-TOF质谱平台检测33种呼吸道病原体的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种MALDI

【技术实现步骤摘要】
一种MALDI
‑
TOF质谱平台检测33种呼吸道病原体的试剂盒


[0001]本专利技术属于核酸检测
，具体涉及一种MALDI
‑
TOF质谱平台检测33种呼吸道病原体的试剂盒。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒(SARS
‑
CoV
‑
2)是一种新型高传染性的冠状病毒，属于β类冠状病毒属C谱系，基因大小约为29.8kb。对SARS
‑
CoV
‑
2的S蛋白序列分析表明，虽然与 SARS
‑
CoV的S蛋白之间有区别，但是同源性很高。与SARS
‑
CoV的S蛋白相比发生了27个氨基酸替换，其中S1的受体结合结构域(Receptor
‑
binding domain，RBD) 上的357～528位有6个替换，569～655位的支持亚区有6个替换。但SARS
‑
CoV
‑
2 与其他β属冠状病毒不同的，其S蛋白的RBD结构则更靠近三聚体的中央部位，其3 个RBD中的1个会向上螺旋，突出的插入序列让S蛋白形成能够轻易与宿主受体 ACE2结合的空间构象，提示其传染性更强。另外，在S蛋白上发现了一个特殊的Furin 样切割位点位于S1和S2亚区之间，这是其他SARS样冠状病毒所没有的，而高致病性禽流感H5N1的血凝素(Hemagglutinin，HA)上也有一个类似的插入位点，扩大了病毒的组织嗜性。
[0003]目前，SARSr/>‑
CoV
‑
2的实验室检测主要包括病毒分离、病毒核酸、抗原和抗体检 测。其中以核酸检测为主要的实验室检测方法，而核酸检测：包括病毒基因组测序及 实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative Real time PCR，RT
‑
qPCR)检测。新型冠状 病毒引起的肺炎症状与临床上常见的呼吸道病原体，如流感病毒、副流感病毒、腺病 毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、人偏肺病毒等引起的临床表现存在相似之处，难以通 过临床表现、胸部影像学鉴别。新型冠状病毒合并感染的病例，其临床表现更重，病 程更长。因此，在收诊新冠患者或疑似患者过程中，需要评估其他感染的可能性，以 便临床分类、隔离和治疗。然而，目前临床上对于其他呼吸道病原体的筛查并不容易 快速实现。无论是上呼吸道还是下呼吸道的感染，以单一病原体为检测目的的检测方 法并不能满足临床需求。所以临床上迫切需要广谱、迅速、准确的呼吸道病原体检测 平台来识别病原体，以帮助判断病情，从而实现针对性的治疗。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种MALDI
‑
TOF质谱平台单反应孔同时检测33种呼吸道病原体的试剂盒，该试剂盒灵活性与可扩展性兼备，操作简单且高通量自动化，能满足新型冠状病毒(SARS
‑
CoV
‑
2)及常见呼吸道病原体大规模人群分子筛查和常规基因诊断的要求。
[0005]本专利技术的第一个目的在于提供一组MALDI
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TOF质谱平台单反应孔同时检测33 种呼吸道病原体的多重PCR扩增引物。
[0006]本专利技术的第二个目的在于提供一组MALDI
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TOF质谱平台单反应孔同时检测33种呼吸道病原体的单碱基延伸引物。
[0007]本专利技术的第三个目的在于提供一个MALDI
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TOF质谱平台单反应孔同时检测33种呼吸道病原体的组合物。
[0008]本专利技术的第四个目的在于所述多重PCR扩增引物在制备MALDI
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TOF质谱平台检测33种呼吸道病原体检测试剂盒中的应用。
[0009]本专利技术的第五个目的在于所述单碱基延伸引物在制备MALDI
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TOF质谱平台检测 33种呼吸道病原体检测试剂盒中的应用。
[0010]本专利技术的第六个目的在于一种MALDI
‑
TOF质谱平台单反应孔同时检测33种呼吸道病原体的试剂盒。
[0011]本专利技术的上述目的是通过以下方案予以实现的：
[0012]本专利技术基于以新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)RdRP基因(位于ORF1ab编码框) 及编码核衣壳蛋白E基因的特异性保守序列为靶区域，进行双靶标基因的设计，其余病原体均为单靶标设计，以其特异性保守序列为靶区域。此外，引入内源性内标，可有效防止假阴性的出现。根据病原体的特异性保守序列设计的引物用于扩增对应的核酸片段，并在靶区域设计延伸引物。PCR反应扩增病原体的保守基因序列，特异延伸引物在靶区域结合，样本经特定处理后与芯片基质共结晶，瞬时纳秒(10
‑
9s)强激光激发，基质将吸收的激光脉冲能量转移给待分析样品，按荷质比加以分离。离子捕获仪收集并储存脉冲信号，并对其进行质谱分析，通过比较A、T、G和C的信号强度及毗邻信号间质量的差异(ddATP＝271.2，ddCTP＝247.2，ddGTP＝287.2，ddTTP＝327.1) 可得出模板序列的信息，从而实现病原体的检测。
[0013]因此本专利技术要求保护一组MALDI
‑
TOF质谱平台单反应孔同时检测33种呼吸道病原体的多重PCR扩增引物，所述引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1～70所示。
[0014]一组MALDI
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TOF质谱平台单反应孔同时检测33种呼吸道病原体的单碱基延伸引物，所述引物核苷酸序列如SEQ ID NO：71～105所示。
[0015]多重PCR扩增引物包括：
[0016](1)特异性扩增新型冠状病毒ORF1ab基因某段序列的引物，
[0017]F1：5
’‑
ACGTTGGATGCCCTGTGGACTTAAGTTTTAC
‑3’
(SEQ ID NO:1)，
[0018]R1：5
’‑
ACGTTGGATGACGATTGCTGAGTGCATCA
‑3’
(SEQ ID NO:2)；
[0019](2)特异性扩增新型冠状病毒E基因某段序列的引物，
[0020]F2：5
’‑
ACGTTGGATGGCTTTCTTGCTGTGGTATTC
‑3’
(SEQ ID NO:3)，
[0021]R2：5
’‑
ACGTTGGATGAACGCAGTACGAATATTGCA
‑3’
(SEQ ID NO:4)；
[0022](3)特异性扩增中东呼吸系统综合征冠状病毒基因某段序列的引物，
[0023]F3：5
’‑
ACGTTGGATGCCACTACTCGTCATCCCATTG
‑3’
(SEQ ID NO:5)，...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一组MALDI
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TOF质谱平台单反应孔同时检测33种呼吸道病原体的多重PCR扩增引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 1～70所示。2.一组MALDI
‑
TOF质谱平台单反应孔同时检测33种呼吸道病原体的单碱基延伸引物，其特征在于，所述引物核的苷酸序列如SEQ ID NO：71～105所示。3.一个MALDI
‑
TOF质谱平台单反应孔同时检测33种呼吸道病原体的组合物，其特征在于，包括权利要求1所述多重PCR扩增引物和权利要求2所述单碱基延伸引物。4.权利要求1所述多重PCR扩增引物在制备MALDI
‑
TOF质谱平台检测33种呼吸道病原体检测试剂盒中的应用。5.权利要求2所述单碱基延伸引物在制备MALDI
‑
TOF质谱平台...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱安娜，许旭平，李明，李晓敏，刘启祥，李婕，杨学习，
申请(专利权)人：广州市达瑞生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：