一种无血清培养基在培养癌组织起源球状体中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种无血清培养基，包括基础培养基、血清白蛋白、ROCK抑制剂、B27、Heregulin、Activin A、EGF、bFGF、烟酰胺、NEAA、Trace Elements A、Trace Elements B、Trace Elements C、2‑巯基乙醇。利用此无血清培养基建立了一种方便、快速、稳定的癌组织起源球状体的培养方法，优化原有培养方法中的培养基组成与制备方法，提供稳定可控的无血清培养方案，以解决现有三维培养方案中原代肿瘤细胞样本量不足、增殖作用有限的问题，为制备CTOS生物样本库以及为癌症患者进行个性化药物评估和筛选提供模型支持。

【技术实现步骤摘要】
一种无血清培养基在培养癌组织起源球状体中的应用
本专利技术涉及细胞培养
，更具体地，涉及一种无血清培养基在培养癌组织起源球状体中的应用。
技术介绍
恶性肿瘤是威胁人类健康的常见疾病，位居人类疾病三大主要死亡原因之首，占所有疾病死因的四分之一。随着经济的发展和生活水平的提高，肿瘤的发病率呈逐年上升的态势，预计到2030年，全球肿瘤的发病和死亡人数将分别达到2640万和1700万。肿瘤的治疗主要依赖于外科手术、放化疗、靶向治疗与免疫治疗等技术手段。在全球大力发展精准医疗技术的大背景下，抗癌新药的开发日益重要，越来越多的抗癌新药从实验室研究走向临床应用。一方面，我们通过高通量测序技术寻找药物靶点，另一方面也需要肿瘤药物模型来验证药物的有效性。目前，常见的肿瘤模型主要包括商品化的细胞系、原代肿瘤细胞模型、动物模型等，这些模型的应用加速了抗癌新药的开发进程。特别是近年来细胞三维培养技术的快速发展，不仅有望应用于药物的临床前研究，也可为临床医生制定个性化诊疗方案提供依据。最简单的三维培养模型是一个细胞的球形集合，称为球状体。尽管三维培养的商品化细胞系被广泛使用，不过，在已建立的细胞系中丢失的原始肿瘤特性，可能并不能通过强制的三维结构完全恢复。动物模型能够在由基质和宿主细胞(包括成纤维细胞、内皮细胞、血细胞和免疫细胞)组成的相对接近人体的微环境中评估候选药物的疗效，这些模型使药效学和药代动力学的评价成为可能。人源肿瘤异种移植(patient-derivedxenograft，PDX)模型是指将患者的新鲜肿瘤组织或肿瘤细胞通过原位或异位等方式移植到免疫缺陷小鼠体内，依靠小鼠提供的环境生长的一种异种移植模型。该模型可以直接模拟肿瘤在人体内的自然生长过程，最大限度地保持其原有的生物学特性。PDX模型的成瘤时间一般为2-4个月，建模成功率为23％～75％。诸多研究表明，PDX模型可作为特定患者的替代模型，用于抗癌药物筛选，指导肿瘤个体化治疗。与二维培养的细胞系相比，PDX中的肿瘤细胞更能保留原始肿瘤细胞特征，更加接近于体内细胞的真实情况。然而，动物模型涉及动物个体差异、免疫排斥等问题，存在成瘤率低且不稳定、建模时间长、价格昂贵、很难建立高通量平台等诸多不足，仍需要大量科学研究进行解决。癌组织起源球状体(cancertissue-originatedspheroid，CTOS)，是原代肿瘤细胞组成的细胞球，作为一种原代肿瘤细胞的三维立体培养模型，具有与体内原发组织接近的细胞生物学特性、培养成功率高、可存储等优势，是一种理想的体外药物检测模型。2011年KondoJ团队首次公开CTOS制备方法(KONDO,Jumpei,etal.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2011,108.15:6235-6240.)，该方法不需要将肿瘤细胞分散成单个细胞，在细胞--基质相互作用的酶消化和细胞培养过程中始终保持肿瘤细胞间的相互接触。在较温和的条件下，肿瘤组织被不完全消化成细胞簇，生成的细胞簇和细胞通过网状过滤器，被过滤器捕获的细胞簇进行进一步的培养。在胚胎干细胞培养基中进一步培养，这些组织消化的原代细胞可以在24小时内迅速形成球状体。由于失巢凋亡被抑制，细胞死亡数量较少，培养成功率大大提高。与动物模型相比，该方法具有培养周期短、成本低、成功率更高的优势，为临床级肿瘤药物敏感性测试应用提供了可能性。然而，现有方法仍存在一定的不足，如CTOS制备过程中，细胞损失量大；CTOS的挑选主要依赖人工操作，费时费力、通量低；CTOS培养增殖作用有限、增殖缓慢，对于肿瘤组织量采集有限的样本，其临床应用仍存在较大的局限性。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种无血清培养基在培养癌组织起源球状体中的应用。本专利技术在原有方法的基础上进行改进，优化了培养基的配方，使其更有利于肿瘤细胞增殖；将单细胞过滤去除调整为CTOS培养后，有助于获得尽可能多的细胞球样体；在进行CTOS培养时，将其平铺于包被有胶原凝胶溶液的培养容器中或直接将CTOS均匀混合于胶原凝胶溶液中，不需要对CTOS进行一一挑选，操作快速方便。本专利技术的第一个目的是提供一种无血清培养基。本专利技术的第二个目的是提供任一所述的无血清培养基在癌组织起源球状体的培养中的应用。本专利技术的第三个目的是提供一种癌组织起源球状体的培养方法。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案予以实现的：本专利技术提供了一种方便、快速、稳定的扩增癌组织起源球状体的培养方法，以解决现有技术中存在的原代肿瘤细胞样本量不足、增殖作用有限的问题。该方法培养体系采用无血清培养基，培养条件稳定可控。通过本方法培养的CTOS可长期培养传代，基因型稳定，而且可以冻存，复苏后可继续稳定培养。本方法可以扩大原发肿瘤细胞的数量，建立起属于患者的特定细胞库，为临床患者的个体化治疗提供可靠的技术支持。此外，通过扩建CTOS生物样本库，可以获得各种类型的肿瘤模型，可广泛应用于肿瘤基础研究、肿瘤个体化治疗、抗肿瘤药物研发等方面，推动癌症诊疗技术的发展。因此本专利技术要求保护一种无血清培养基，包括基础培养基、血清白蛋白、ROCK抑制剂、B27、Heregulin、ActivinA、EGF、bFGF、烟酰胺、NEAA、TraceElementsA、TraceElementsB、TraceElementsC、2-巯基乙醇。TraceElementsA为Mediatech99-182-CI1000×；TraceElementsB为Mediatech99-176-CI1000×；TraceElementsC为Mediatech99-175-CI1000×。优选地，所述血清白蛋白(SA)为牛血清白蛋白(BSA)或人血清白蛋白(HSA)中的一种或两种的混合物。更优选地，所述血清白蛋白(SA)为牛血清白蛋白(BSA)，在所述培养基中牛血清白蛋白(BSA)浓度为0.1％～10％(w/v)。进一步优选地，在所述培养基中牛血清白蛋白(BSA)浓度为1.55％(w/v)。优选地，所述的ROCK抑制剂为Y27632、thiazovivin、Fasudil(HA-1077)、GSK429286A、GSK429286A、RKI-1447、Azaindole1(TC-S7001)、GSK269962、Netarsudil(AR-13324)、Y-39983、ZINC00881524、Ripasudil(K-115)hydrochloridedihydrate、Hydroxyfasudil(HA-1100)中的一种或几种的混合物。更优选地，所述ROCK抑制剂为Y27632，在所述培养基中Y27632的浓度为1～50μM。进一步优选地，在所述培养基中Y27632的浓度为10μM。优选地，所述基础培养基为DMEM/F12、AdvancedDMEM/F-12、RPMI1640、DMEM、或F-12的一种。基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种无血清培养基，其特征在于，包括基础培养基、血清白蛋白、ROCK抑制剂、B27、Heregulin、Activin A、EGF、bFGF、烟酰胺、NEAA、Trace Elements A、Trace Elements B、Trace Elements C、2-巯基乙醇。/n

【技术特征摘要】
1.一种无血清培养基，其特征在于，包括基础培养基、血清白蛋白、ROCK抑制剂、B27、Heregulin、ActivinA、EGF、bFGF、烟酰胺、NEAA、TraceElementsA、TraceElementsB、TraceElementsC、2-巯基乙醇。


2.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述血清白蛋白为牛血清白蛋白或人血清白蛋白中的一种或两种的混合物。


3.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述血清白蛋白为牛血清白蛋白(BSA)，在所述培养基中牛血清白蛋白浓度为0.1％～10％(w/v)。


4.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述的ROCK抑制剂为Y27632、thiazovivin、Fasudil、GSK429286A、GSK429286A、RKI-1447、Azaindole1、GSK269962、Netarsudil、Y-39983、ZINC00881524、Ripasudilhydrochloridedihydrate、Hydroxyfasudil中的一种或几种的混合物。


5.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述ROCK抑制剂为Y27632，在所述培养基中Y27632的浓度为1～50μM。


6.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述基...

【专利技术属性】
技术研发人员：万勇，徐中华，何志华，李明，
申请(专利权)人：广州市达瑞生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44