一种循环肿瘤细胞快速检测试剂盒及其制备和应用方法技术

一种循环肿瘤细胞快速检测试剂盒及其制备和应用方法。本试剂盒联合免疫捕获和膜过滤的方法分离循环肿瘤细胞。所述试剂盒包括循环肿瘤细胞吸附剂、肿瘤细胞荧光纳米探针、白细胞荧光纳米探针；所述循环肿瘤细胞吸附剂中肿瘤细胞表面特异性抗体选自：EpCAM或EGFR；所述白细胞荧光纳米探针中白细胞特异性抗体选自：CD45、CD15或CD33；所述肿瘤细胞荧光纳米探针中肿瘤细胞特异性抗体选自：CK8/CK18/CK19、PanCK、Vimentin或plastin‑3；本试剂盒具有操作便捷、检测时间短、快速准确、无需大型仪器、可降低癌症筛查成本、易被患者接受等特点，可产生良好的经济和社会效益。

Circulating tumor cell rapid detection kit and preparation method and application method thereof

Circulating tumor cell rapid detection kit and preparation method and application method thereof. The kit combines the methods of immune capture and membrane filtration to isolate circulating tumor cells. The kit includes a circulating tumor cell adsorbent, tumor cells fluorescent probes and leukocyte fluorescent probes; the tumor of circulating tumor cells in the sorbent cell surface specific antibody is selected from EpCAM or EGFR; the white cell fluorescent probes in white blood cell specific antibodies from CD45, CD15 or CD33; tumor cell specific antibodies from the tumor cell fluorescent probes: CK8/CK18/CK19, PanCK, Vimentin or plastin 3; the kit has the characteristics of convenient operation, short detection time, fast and accurate, without large instrument, can reduce the cost of screening for cancer, is easy to be accepted by patients, can produce good economic and social benefit.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医药
，涉及医学和生物技术，具体涉及循环肿瘤细胞快速检测试剂盒及其制备和应用方法。
技术介绍
生活环境的恶化，不良生活习惯和遗传因素使人类患癌症的几率越来越高，癌症已成为人类健康“第一杀手”，是全球关注的焦点。然而随着医学的不断进步，癌症已经不是人们眼中的绝症，大部分癌症如能早期发现、早期诊断、正确治疗是可以治愈的，即使癌症中晚期患者经过治疗也可减轻痛苦、延长生命。近年来，尽管随着早期诊断和预防、手术治疗、化疗、放疗等治疗方式的出现，癌症的生存率已经有了很大的改善，但是目前这些疗法对于解救全球上千万的癌症患者还是远远不够的。循环肿瘤细胞(Circulatingtumourcells，CTCs)指自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞。随着生物技术的迅速发展，CTC快速检测技术在癌症治疗紧迫的形式下应运而生，该技术是目前最具发展潜力的肿瘤无创诊断和实时疗效监测手段。外周血中的CTC数量极少，因此如何从几百万白细胞及几十亿红细胞中快速、特异性的、不遗漏的分选富集出CTC成为制约其为临床肿瘤早期诊断的主要问题。随着CTC临床应用价值凸显，许多研发团队都在推出不同的CTC检测技术。目前CTC捕获原理通常是基于CTC表面标志物和细胞尺寸。基于CTC表面标志物原理捕获CTC的技术有：CellSearch系统、MACS(通过免疫磁珠标记的捕获)、CTC-chip(CTC-芯片)、iFISH-CTC(免疫荧光染色结合FISH技术)等，这些技术的存在最大的缺点是：容易产生假阳性或假阴性结果，操作复杂，成本高，普及难度大。基于细胞尺寸大小原理捕获CTC的技术有ScreenCell等，该技术原理最大的缺点是：体积较小，形态变化好的CTC容易漏检，染色过程复杂，易丢失CTC。此外，国内外许多研究团队还推出了CTC表面标志物和细胞尺寸原理相结合的技术方案，如免疫磁珠阴性富集结合过滤法，这种技术方案较好的集合了两种原理的优势，CTC纯度较高、CTC团块富集效果好、便于后续分析、适合所有类型肿瘤，但该技术也存在着较大的局限性，如：体积较小，形态变化好的CTC容易漏检；表达白细胞表面标志物的CTC漏检(如：CTC相关性巨噬细胞，具有白细胞特性的CTC)；样品处理时间长，费用高。因此，如今迫切需要建立一种快速、准确、价格适中的CTC检测和分离技术，作为癌症常规筛查手段。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有循环肿瘤细胞富集和检测技术存在的上述不足，提供一种操作简单、处理时间短、结果可靠、价格适中的循环肿瘤细胞快速检测试剂盒及其制备和应用方法。本专利技术技术方案一种循环肿瘤细胞快速检测试剂盒，包括循环肿瘤细胞吸附剂、细胞核特异性探针、肿瘤细胞荧光纳米探针、白细胞荧光纳米探针、微孔滤膜、PBS缓冲液、裂解液、固定液、封闭液、空采血管、过滤装置和染色池。所述的特异性循环肿瘤细胞吸附剂；是载体通过偶联剂与循环肿瘤细胞表面特异性单克隆抗体形成的载体-抗体复合物。所述的载体材料为聚乙烯醇、聚苯乙烯或聚丙烯酸酯类，形状为球状，粒径为10-100μm，表面引入活性基团，所述活性基团包括氨基、羟基、羧基或醛基，具有良好的亲水性和血液相容性。所述的偶联剂为生物交联剂或化学交联剂，生物交联剂具体为DCC(二环己基碳二亚胺)或DPS(3,3’—二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)，化学偶联剂选自戊二醛或乙酸酐。所述的循环肿瘤细胞表面特异性单克隆抗体具体是EpCAM或EGFR单克隆抗体。所述的细胞核特异性探针具体是DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)或Hoechst33258。所述的肿瘤细胞荧光纳米探针是由CK8/CK18/CK19、PanCK、Vimentin或plastin-3肿瘤细胞特异性抗体与荧光纳米量子点通过偶联剂偶联制得。所述的白细胞荧光纳米探针是由CD45、CD15或CD33白细胞特异性抗体与荧光纳米量子点通过偶联剂偶联制得。进一步地，所述的荧光纳米量子点材料是非金属量子点荧光材料、或金属量子点荧光材料、或贵金属量子点荧光材料，荧光量子点粒径为0.1-2.0μm，激发光波长为200-700nm，荧光发光色为蓝色、绿色、橙色或者红色，且表面带有丰富的羧基、羟基或醛基活性基团，水溶性强。所述的偶联剂具体是EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，可与带有氨基的分子偶联。进一步地，所述的细胞核特异性探针、肿瘤细胞荧光纳米探针、白细胞荧光纳米探针三者荧光发光色不同；所述的微孔滤膜材料为聚碳酸酯或纤维素，孔径为5-10μm，有很好的强度和可操作性。所述的(红细胞)裂解液主要成分为NH4Cl，在裂解红细胞的同时几乎不损伤有核细胞。如下述配方的裂解液：8.29-13g/LNH4CL、1-1.5g/LKHCO3和0.37-0.5g/LNa2EDTA。所述的固定液为包含以下浓度组分的溶液：2wt％-4wt％多聚甲醛、0.5wt％-1wt％tritonx-100。所述的封闭液为5wt％BSA的PBS溶液。本专利技术同时提供了一种上述试剂盒的制备方法，其步骤为：①循环肿瘤细胞吸附剂制备a、取粒径为10-100μm，材料为聚乙烯醇、聚苯乙烯或聚丙烯酸酯类的载体微球5ml，加入10ml10mol/L的NaOH，60ml环氧氯丙烷，于50℃水浴震荡活化1-2小时，用蒸馏水洗涤3次，每次1min，加入8ml3mol/L的NaOH，30ml的1，6-己二胺，于60℃水浴震荡反应12h，用蒸馏水洗涤3次，每次3min，备用。b、取上述处理后的微球，加入20mlPBS(磷酸缓冲液，PH7.2)，溶胀微球，加入过量预先配制好的DCC、DPS、戊二醛或乙酸酐溶液，搅拌混匀，室温反应1h，吸弃反应液，PBS洗涤3次，每次5min，备用。c、取上述b步处理后的微球，加入预先配制好的15μg/ml的EpCAM或EGFR抗体溶液2-5ml，搅拌混匀，于37℃反应3h，即得到吸附剂溶液，4℃保存。②肿瘤细胞荧光纳米探针制备a、取粒径为0.1-2μm的荧光量子点1mg溶于0.5mlPBS，制成荧光量子点溶液；b、称取5mgEDC和5mgNHS，分别加入5mlPBS溶解，配制成浓度为1mg/ml的EDC溶液和浓度为1mg/ml的NHS溶液，取300μlEDC溶液加入上述荧光量子点溶液，于4℃震荡反应15min，再加入300μlNHS溶液，混匀反应30min，用PBS快速洗涤两次，备用。c、将5-10μg的CK8/CK18/CK19、PanCK、Vimentin或plastin-3抗体加入到上述荧光量子点中，室温下震荡反应4h；用PBS洗涤3次，去除未反应的抗体，最后分散于100μLPBS(含有0.05％NaN3和1％BSA)中，置于4℃保存备用。③白细胞荧光纳米探针制备a、取粒径为0.1-2μm的荧光量子点1mg溶于0.5mlPBS，制成荧光量子点溶液；b、称取5mgEDC和5mgNHS，分别加入5mlPBS溶解，配制成浓度为1mg/ml的EDC溶液和浓度为1mg/ml的NHS溶液，取300μlEDC溶液加入上述荧光量子点溶液，于4℃震荡反应15min，再加入300μlNHS本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种循环肿瘤细胞快速检测试剂盒，其特征在于：包括循环肿瘤细胞吸附剂、细胞核特异性探针、肿瘤细胞荧光纳米探针、白细胞荧光纳米探针、微孔滤膜、缓冲液、裂解液、固定液、封闭液、空采血管、过滤装置和染色池。

【技术特征摘要】
1.一种循环肿瘤细胞快速检测试剂盒，其特征在于：包括循环肿瘤细胞吸附剂、细胞核特异性探针、肿瘤细胞荧光纳米探针、白细胞荧光纳米探针、微孔滤膜、缓冲液、裂解液、固定液、封闭液、空采血管、过滤装置和染色池。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的循环肿瘤细胞吸附剂是载体通过偶联剂与循环肿瘤细胞表面特异性单克隆抗体形成的载体-抗体复合物；所述的载体材料为聚乙烯醇、聚苯乙烯或聚丙烯酸酯类，形状为球状，粒径为10-100μm，表面引入活性基团，所述活性基团包括氨基、羟基、羧基或醛基，具有良好的亲水性和血液相容性。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：其特征在于所述的循环肿瘤细胞表面特异性单克隆抗体具体是EpCAM或EGFR单克隆抗体。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的细胞核特异性探针具体是DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)或Hoechst33258。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的肿瘤细胞荧光纳米探针是由CK8/CK18/CK19、PanCK、Vimentin或plastin-3肿瘤细胞特异性抗体与荧光纳米量子点通过偶联剂偶联制得。6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的白细胞荧光纳米探针是由CD45、CD15或CD33白细胞特异性抗体与荧光纳米量子点通过偶联剂偶联制得。7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于：所述的荧光纳米量子点材料是非金属量子点荧光材料、或金属量子点荧光材料、或贵金属量子点荧光材料，荧光量子点粒径为0.1-2.0μm，激发光波长为200-700nm，荧光发光色为蓝色、绿色、橙色或者红色，且表面带有丰富的羧基、羟基或醛基活性基团，水溶性强。8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的微孔滤膜材料具体为聚...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文忠，漆敏，
申请(专利权)人：天津普拉德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12