一种高效率循环肿瘤细胞富集方法技术

本发明专利技术提供了一种循环肿瘤细胞的富集方法及其应用，适用于生物技术及医学领域。该循环肿瘤细胞的富集方法包括：将血液样品与通过配体特异性结合白细胞的微球进行孵育、将孵育后样品进行密度梯度离心，以及将上清通过滤膜截留或者进一步离心。本发明专利技术涉及的循环肿瘤细胞富集方法具有富集效率高、灵敏度高，且操作简便、成本低廉的特点。富集后的循环肿瘤细胞没有经过任何标记，能够保持循环肿瘤细胞的原始状态，便于进行后续分析。

【技术实现步骤摘要】
一种高效率循环肿瘤细胞富集方法
本专利技术涉及一种高效率高纯度分离稀有细胞的方法，特别涉及一种从血液中分离高纯度循环肿瘤细胞的方法，本专利技术还涉及一种用于从肿瘤患者外周血中富集循环肿瘤细胞的试剂盒和一种循环肿瘤细胞的富集装置，以及分离出的循环肿瘤细胞的分析方法及其应用。
技术介绍
循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCells,CTCs)是从自发或因诊疗操作由肿瘤原发灶、转移灶等途径播散进入肿瘤患者外周血中的肿瘤细胞，是肿瘤转移灶的直接来源。循环肿瘤细胞CTCs作为原发灶和转移灶之间的连接，是研究肿瘤生物学和转移机制的最佳窗口,是指导个体化肿瘤治疗的绝佳研究对象，最为重要的是可作为具有肿瘤(包括转移灶)代表性的“液体活检”(liquidbiopsy)样本,允许多次、实时、非侵入性获取。鉴于超过90％的癌症死亡是由转移造成的，从血液中检测循环肿瘤细胞越来越引起人们的重视。循环肿瘤细胞对于肿瘤的早期诊断和治疗评估有很重要的临床研究价值，目前已有证据显示肿瘤的侵袭和微转移很可能在肿瘤发生的早期就已出现，很多肿瘤在1毫米的情况下已经可以在血液里检测到循环肿瘤细胞，另外检测外周血中的循环肿瘤细胞数目可用于实体瘤患者的预后以及预测化疗的有效性，并用来指导实体瘤患者的病程分期和复发监控，具体包括乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌、肾细胞癌和黑色素瘤等。CTCs富集关键在于如何从复杂的血液环境中高效、迅速、准确地富集CTCs。血液循环系统存在着数量巨大的血液细胞，包括红细胞约5×109个/mL、白细胞约7×106个/mL及血小板约3×108个/mL。而CTCs数量极为稀少，转移癌患者体内每毫升血液中只有1个到几十个CTCs，大量血液细胞的存在严重干扰CTCs的富集，因此CTCs在血液检测中极具挑战性。CTCs的富集效果(尤其富集效率)直接影响了对病人肿瘤诊断的预判以及后续的基因检测等，因此高富集效率、高灵敏度、高纯度、高通量以及高活性的CTCs富集技术成为近年来的研究热点和难点。CTCs的富集方法主要分为物理法和生物化学法两大类。物理法基于肿瘤细胞与正常细胞物理性质，如大小、变形性、密度、介电性等的差异，利用外力场比如磁场，流体场，电场等的作用进行分离捕获。生物化学法通常依赖于细胞膜表面的抗原与偶联在分离介质上的抗体相结合，以达到分离捕获的目的。具体来讲，凭借众多学者专家的努力，多种基于不同机制的技术被用于CTCs的检测，主要包括基于细胞密度的离心法、基于细胞体积大小的滤膜过滤法(isolationbysizeofepithelialtumorcells，ISET)、基于肿瘤标记物的免疫磁珠法(magneticactivatedcellsorting,MACS)、基于微流控芯片的CTC-Chip技术等CTCs富集技术。其中，免疫磁珠法是目前最常用的CTCs分离和富集的技术。免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原分子与连接在磁珠上的特异性单抗结合,形成抗原—抗体—磁珠免疫复合物，在外加磁场的作用下发生力学移动,将含有靶抗原的目的细胞与其他细胞分离，从而达到特异性分离细胞的目的，具有简便易行、分离纯度高、保留细胞活性的优点。免疫磁珠法富集CTCs，具体可分为阳性富集策略和阴性富集策略。前者通过磁珠偶联上皮细胞黏附分子EpCAM和细胞角蛋白CK等标志直接富集外周血中上皮来源的稀有细胞。后者通过磁珠偶联CD45等白细胞标志或巨噬细胞、血小板表达的CD61，去除外周血白细胞而间接富集稀有上皮细胞。近年来，纳米技术制造的纳米级(10～100nm)磁珠被用于外周肿瘤细胞的富集分离，用与肿瘤特异性表面抗原相对应的单克隆抗体包被免疫磁珠，以此磁珠对肿瘤患者外周血样本中的肿瘤细胞进行浓缩、分离，可对肿瘤细胞进行104～2×105倍的富集，大大提高了外周血样本中肿瘤细胞的浓度，从而提高检测的敏感性。EpCAM是目前最优的肿瘤特异性表面抗原，但有研究显示大多数恶性肿瘤的CTCs会丢失该抗原，因此基于EpCAM抗原的方法可能会漏检CTCs。研究发现134种组织类型不同的肿瘤细胞，只有70％表达EpCAM抗原，同时还存在该抗原在不同患者中表达强度不一、在循环肿瘤细胞群体中表达强度不一的问题。目前，尚没有一种100％特异性的肿瘤特异性表面抗原。因此，开发不依赖于CTCs特异性表面抗原的分离方法也是一个重要方向。阴性富集策略不依赖于肿瘤特异性表面抗原，采用免疫磁珠法，通过有效去除CD45+的白细胞或CD61+的巨噬细胞、血小板等外周血其他细胞而间接富集CD45或CD61阴性的稀有细胞，克服了EpCAM阳性富集策略的缺陷。但这种阴性富集策略得到的产物纯度较低，特异性不高，回收率也有待提高。整体上，传统的密度梯度离心法、细胞大小过滤法存在富集效率低的致命缺陷，免疫磁珠阳性富集法存在操作繁琐、使用不方便、漏检等缺点，微流控芯片技术则存在成本高、技术难度高等缺点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种循环肿瘤细胞的富集方法，所述方法包括步骤：(1)将样品与白细胞特异性结合的微球进行孵育；(2)将孵育后样品加入密度梯度离心介质的分离管中进行密度梯度离心；(3)收集分离管上层液体，通过滤膜截留或者再次离心得到循环肿瘤细胞。在一优选实施例中，所述微球直径范围为1nm至200μm，密度范围为1.01-5.5g/mL，优选微球直径范围为1-10μm，密度范围为1.3-4.0g/mL，进一步优选微球密度范围为1.6-2.5g/mL。在另一优选实施例中，所述微球为磁性或非磁性，所述微球可含有聚苯乙烯、四氧化三铁、三氧化二铁、二氧化硅、右旋糖苷、琼脂糖、交联葡聚糖、明胶、藻多糖或其他高密度材质中的一种或以上成分，所述微球优选为聚苯乙烯塑料微球、二氧化硅微球或磁性微球中的一种。在另一优选实施例中，所述微球为经过表面修饰的表面活化微球，所述表面修饰方式为羟基修饰、羧基修饰、乙酰化修饰、硅烷化修饰、生物素修饰、亲和素修饰、链霉亲和素修饰、蛋白A修饰、蛋白G修饰、蛋白A/G修饰、蛋白L修饰、二抗修饰及其他修饰方式。在另一优选实施例中，所述微球数量与白细胞数量的比例范围为1:1至1000:1。在另一优选实施例中，所述微球上直接或间接、共价或非共价偶联有与白细胞特异性结合的配体。在另一优选实施例中，所述与白细胞特异性结合的配体选自抗体、多肽、蛋白、核酸、适配体及其他行使与白细胞结合功能的无机物、有机物。在另一优选实施例中，所述抗体为CD45抗体或CD45抗体与选自CD2、CD3、CD4、CD8、CD15、CD16、CD32、CD45、CD56、CD61b及其他识别血源细胞的抗体中的一种或以上的组合。在另一优选实施例中，所述配体为单克隆抗体或多克隆抗体。在另一优选实施例中，该方法采用的分离管为淋巴细胞或PBMC分离管，所述淋巴细胞或PBMC分离管具有可隔离密度梯度离心后形成的白膜层与下方红细胞沉淀的结构。在另一优选实施例中，所述密度梯度离心介质密度范围为1.050-1.7g/mL，优选1.078-1.091g/mL。所述密度梯度离心介质成分包括聚蔗糖、泛影葡胺、葡聚糖胺、氯化铷、溴化铯、碘克沙醇及其他具有特定密度特性的化合物，通过对以上成分不同比例混合或其他介质稀释得到具有特本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种循环肿瘤细胞富集方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将样品与特异性结合白细胞的微球进行孵育；(2)将孵育后的样品在加入密度梯度离心介质的分离管中进行密度梯度离心；(3)收集分离管上层液体，通过滤膜截留或者再次离心得到循环肿瘤细胞。

【技术特征摘要】
1.一种循环肿瘤细胞富集方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将样品与特异性结合白细胞的微球进行孵育；(2)将孵育后的样品在加入密度梯度离心介质的分离管中进行密度梯度离心；(3)收集分离管上层液体，通过滤膜截留或者再次离心得到循环肿瘤细胞。2.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞富集方法，其特征在于，所述微球密度范围为1.01-5.5g/ml，优选密度范围为1.3-4.0g/ml；所述微球直径范围为1nm至200μm，优选直径范围为1-10μm。3.根据权利要求1和权利要求2所述的循环肿瘤细胞富集方法，其特征在于，所述与白细胞特异性结合的配体为抗体、多肽、蛋白、核酸、适配体及其他行使与白细胞结合功能的无机物、有机物。4.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞富集方法，其特征在于，所述密度梯度离心介质密度范围为1.050-1.7g/mL，最佳密度范围为1.078-1.091g/mL。5.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞富集方法，其特征在于，所述分离管为淋巴细胞或PBMC分离管，所述分离管具有可隔离密度梯度...

【专利技术属性】
技术研发人员：毕国明，
申请(专利权)人：毕国明，
类型：发明
国别省市：广东,44