循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒，其包括针对每种标志基因mRNA的捕获探、针、扩增探针和标记探针，所述标志基因mRNA包括有如下两类：选自EPCAM、E-cadherin、CEA、KRT5、KRT7、KRT17、KRT20中的至少两种的上皮细胞标志基因mRNA，选自VIMENTIN、N-cadherin、TWIST1、AKT2、ZEB2、ZEB1、FOXC1、FOXC2、SNAI1、SNAI2中的至少两种的间质细胞标志基因mRNA。本发明专利技术避免了血液中非肿瘤上皮细胞及采样过程引入正常上皮细胞等因素造成的假阳性结果，确保检测到上皮细胞标志基因和/或间质细胞标志基因的细胞为循环肿瘤细胞，进一步提高了检测结果的准确度和可信度。

【技术实现步骤摘要】
循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒
本专利技术属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒。
技术介绍
循环肿瘤细胞(CTC，CirculatingTumorCell)是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，因自发或诊疗操作从实体肿瘤病灶(原发灶、转移灶)脱落，大部分CTC在进入外周血后发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并锚着发展成为转移灶，增加恶性肿瘤患者死亡风险。近年来研究表明，肿瘤细胞在进入外周血循环的过程中可能发生上皮-间质转变(ETM，Epithelial-mesenchymalTransition)，发生上皮-间质转化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)的肿瘤细胞迁移和侵袭能力增强。有研究者应用免疫荧光染色检测转移性NSCLC患者CTCs间质标志物vimentin及上皮标志物KeratinmRNA的表达情况，结果在来自于检测的几乎所有CTCs中都可以观察到共同强表达这2个指标，没有发现只表达keratinmRNA的CTCs，但在3例患者中检测到很少几个只表达vimentinmRNA的CTCs。此研究首次证实了具有上皮/间质混合性表型CTCs的存在。而NSCLC原发性肿瘤的表型则是keratinmRNA阳性、vimentinmRNA阴性。此外，其他研究者应用AdnaTest方法检测乳腺癌患者CTCs中3种EMT标志物mRNA(TWIST1、Akt2、PI3Kα)，结果29％患者至少一种阳性。有学者分析乳腺癌患者CTCs单细胞转录谱后发现，尽管CTCs之间存在基因表达差异，但是普遍高表达EMT相关分子TGF-β1、vimentin和CXCR4。另外一些实验也证实肿瘤患者CTCs高频出现共表达上皮标志物(EpCAM、cytokeratins、E-cadherin)、间质标志物(vimentin、N-cadherin、O-cadherin)和干细胞标志物(CD133)的现象。在另一项研究中，研究者检测了乳腺癌CTCs中EMT相关转录因子mRNA(TWIST1、SNAIL1、SLUG、ZEB1、FOXC2)的表达情况，并分析了接受或未接受新辅助化疗对CTCs表达这些转录因子的可能影响，发现新辅助化疗并不能清除这些发生了EMT的CTCs。推测EMT很可能通过赋予CTCs干细胞特性使CTCs耐受化疗。因此，检测CTCs亚型对于指导分子靶向药物的研发及临床个体化治疗具有重要意义。目前，多数CTCs检测方法都是以肿瘤细胞表面的上皮细胞标志物为靶点，如上皮细胞黏附分子(epithelialcelladhesionmolecule，EPCAM)，用相应的抗体捕获CTCs，以细胞表达CKs作为主要诊断依据，这类方法涉及的EPCAM和CKs都具有上皮细胞特异性。其中，代表性检测方法是目前唯一通过美国FDA批准进行临床应用的CellSearch系统。由于外周血中可能存在一定数量的非肿瘤性上皮细胞，以及采血可能造成正常上皮细胞污染血样，加上一些CTCs由于发生EMT丢失了上皮抗原而无法被检测到，从而导致假阳性和假阴性的检测结果，此外，免疫磁性分选(MACS)技术联合逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法也是常用的CTC分离与鉴定的技术，但是RT-PCR过程对环境和操作的要求高，且mRNA容易降解，无法进行CTC细胞分型等缺点，因此，急需一种能够准确检测CTCs的技术，实现CTCs的的鉴定与精确分型。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高的循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒。实现上述目的的技术方案如下。一种循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒，包括针对每种标志基因mRNA的捕获探针、扩增探针和标记探针，所述标志基因mRNA包括有如下两类：选自EPCAM、E-cadherin、CEA、KRT5、KRT7、KRT17、KRT20中的至少两种的上皮细胞标志基因mRNA，选自VIMENTIN、N-cadherin、TWIST1、AKT2、ZEB2、ZEB1、FOXC1、FOXC2、SNAI1、SNAI2中的至少两种的间质细胞标志基因；其中，所述捕获探针连接标志基因mRNA与扩增探针，每条捕获探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：与待检测的标志基因mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、P2序列，所述P2序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P4和标志基因mRNA之间均不存在特异性结合的序列，针对同一类别的标志基因的捕获探针的P2序列相同；每条扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与相应捕获探针的P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P4序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；每条标记探针具有与相应扩增探针P4序列互补配对的P5序列，且末端修饰有荧光基团，不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同。在其中一个实施例中，所述标志基因mRNA还包括有白细胞标志基因mRNA的一类，所述白细胞标志基因为CD45。使用白细胞标志mRNA，有助于进一步区分白细胞和肿瘤细胞，排除白细胞对检测结果的干扰，保证结果的准确性。在其中一个实施例中，所述上皮细胞标志基因的捕获探针中：针对EPCAM基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.1～SEQIDNO.10中的2条或2条以上，针对E-cadherin基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.11～SEQIDNO.20中的2条或2条以上，针对CEA基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.21～SEQIDNO.30中的2条或2条以上，针对KRT5基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.31～SEQIDNO.40中的2条或2条以上，针对KRT7基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.41～SEQIDNO.50中的2条或2条以上，针对KRT17基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.51～SEQIDNO.60中的2条或2条以上，针对KRT20基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.61～SEQIDNO.70中的2条或2条以上；针对上皮细胞标志基因的捕获探针的P2序列为SEQIDNO.181；所述上皮细胞标志基因mRNA扩增探针中，P3序列为SEQIDNO.184，P4序列为SEQIDNO.187。在其中一个实施例中，所述间质细胞标志基因的捕获探针中：针对VIMENTIN基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.71～SEQIDNO.80中的2条或2条以上，针对N-cadherin基因特异性序列P1选自SEQIDNO.81～SEQIDNO.90中的2条或2条以上，针对TWIST1基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.91～SEQIDNO.100中的2条或2条以上，针对AKT2基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.101～SEQIDNO.110中的2条或2条以上，针对ZEB2基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.111～SEQIDNO.120中的2条或2条以上，针对ZEB1基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.121～SEQIDNO.130中的2条或2条以上，针对FOXC1基因的特异性序本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒，其特征在于，包括针对每种标志基因mRNA的捕获探针、扩增探针和标记探针，所述标志基因mRNA包括有如下两类：选自EPCAM、E‑cadherin、CEA、KRT5、KRT7、KRT17、KRT20中的至少两种的上皮细胞标志基因mRNA，选自VIMENTIN、N‑cadherin、TWIST1、AKT2、ZEB2、ZEB1、FOXC1、FOXC2、SNAI1、SNAI2中的至少两种的间质细胞标志基因；其中，所述捕获探针连接标志基因mRNA与扩增探针，每条捕获探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：与待检测的标志基因mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、P2序列，所述P2序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P4和标志基因mRNA之间均不存在特异性结合的序列，针对同一类别的标志基因的捕获探针的P2序列相同；每条扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与相应捕获探针的P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P4序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；每条标记探针具有与相应扩增探针P4序列互补配对的P5序列，且末端修饰有荧光基团，不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同。...

【技术特征摘要】
1.一种循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒，其特征在于，包括针对每种标志基因mRNA的捕获探针、扩增探针和标记探针，所述标志基因mRNA包括有如下两类：选自EPCAM、E-cadherin、CEA、KRT5、KRT7、KRT17、KRT20中的至少两种的上皮细胞标志基因mRNA，选自VIMENTIN、N-cadherin、TWIST1、AKT2、ZEB2、ZEB1、FOXC1、FOXC2、SNAI1、SNAI2中的至少两种的间质细胞标志基因；其中，所述捕获探针连接标志基因mRNA与扩增探针，每条捕获探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：与待检测的标志基因mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、P2序列，所述P2序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P4和标志基因mRNA之间均不存在特异性结合的序列，针对同一类别的标志基因的捕获探针的P2序列相同；每条扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与相应捕获探针的P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P4序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；每条标记探针具有与相应扩增探针P4序列互补配对的P5序列，且末端修饰有荧光基团，不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同。2.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒，其特征在于，所述标志基因mRNA还包括有针对白细胞标志基因mRNA的一类，所述白细胞标志基因为CD45。3.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒，其特征在于，所述上皮细胞标志基因的捕获探针中：针对EPCAM基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.1～SEQIDNO.10中的2条或2条以上，针对E-cadherin基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.11～SEQIDNO.20中的2条或2条以上，针对CEA基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.21～SEQIDNO.30中的2条或2条以上，针对KRT5基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.31～SEQIDNO.40中的2条或2条以上，针对KRT7基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.41～SEQIDNO.50中的2条或2条以上，针对KRT17基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.51～SEQIDNO.60中的2条或2条以上，针对KRT20基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.61～SEQIDNO.70中的2条或2条以上；针对上皮细胞标志基因的捕获探针的P2序列为SEQIDNO.181；所述上皮细胞标志基因mRNA扩增探针中，P3序列为SEQIDNO.184，P4序列为SEQIDNO.187。4.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒，其特征在于，所述间质细胞标志基因的捕获探针中：针对VIMENTIN基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.71～SEQIDNO.80中的2条或2条以上，针对N-cadherin基因特异性序列P1选自SEQIDNO.81～SEQIDNO.90中的2条或2条以上，针对TWIST1基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.91～SEQIDNO.100中的2条或2条以上，针对AKT2基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.101～SEQIDNO.110中的2条或2条以上，针对ZEB2基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.111～SEQIDNO.120中的2条或2条以上，针对ZEB1基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.121～SEQIDNO.130中的2条或2条以上，针对FOXC1基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.131～SEQIDNO.140中的2条或2条以上，针对FOXC2基因特异性序列P1选自SEQIDNO.141～SEQIDNO.150中的2条或2条以上，针对SNAI1基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.151～SEQIDNO.160中的2条或2条以上，针对SNAI2基因的特异性序列P1选自SEQIDNO.161～SEQIDNO.170中的2条或2条以上；针对间质细胞标志基因的捕获探针的P2序列为SEQIDNO.1...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘苏燕，吴诗扬，董艳，
申请(专利权)人：益善生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44