检测急性早幼粒细胞白血病相关融合基因的试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及检测急性早幼粒细胞白血病相关融合基因的试剂盒。具体而言，提供一种基于二代测序技术的、可同时检测急性早幼粒细胞白血病(APL)相关的多种RARα融合基因的检测试剂盒、基因检测方法，以及用于上述检测方法的二代测序DNA文库的构建方法、建库试剂盒。本发明专利技术的检测试剂盒包含用于构建二代测序DNA文库的试剂，以及用于对二代测序DNA文库进行上机测序的试剂。

Kit for the detection of acute promyelocytic leukemia related fusion genes

The present invention relates to a kit for the detection of acute promyelocytic leukemia related fusion genes. Specifically, a simultaneous detection of acute promyelocytic leukemia two generation sequencing technology (APL), based on the method of gene detection kit, related to a variety of RAR alpha fusion gene, and the two generation sequencing of DNA library for the detection of the construction method, construction kit. The detection kits of the present invention contain reagents for constructing two generation sequenced DNA libraries, and reagents for sequencing two generations of sequenced DNA libraries.

【技术实现步骤摘要】
检测急性早幼粒细胞白血病相关融合基因的试剂盒
本专利技术涉及可同时检测多种急性早幼粒细胞白血病相关融合基因的试剂盒及检测方法，属于分子检测

技术介绍
急性早幼粒细胞白血病(Acutepromyelocyteleukemia，APL)是一种有着特异基因与染色体核型改变的特殊类型急性白血病。临床表现凶险，起病及治疗过程中容易发生出血和栓塞而引起死亡。近二十年来，由于全反式维甲酸(ATRA)及砷剂的临床应用，APL已成为可以治愈的白血病之一。APL易见于中青年人，平均发病年龄为39岁，流行病学研究证实国外APL发病率占同期白血病的5.0％～23.8％，占急性髓系白血病(AML)的6.2％～40.2％。国内多位学者报道发病率占同期急性白血病的3.3％～21.2％。在基因检测方面，检测融合基因是诊断APL的最特异、敏感的方法之一，也是APL治疗方案选择、疗效分析、预后分析和复发预测最可靠的指标。在APL相关融合基因检测方面，需要首先提取血液或骨髓中的总RNA并反转录得到cDNA，然后针对每种融合基因设计特异Taqman探针进行实时荧光定量PCR扩增检测，或者利用多重巢式RT-PCR定性检测多种融合基因。前一种方法的缺点是检测通量受限且样本需求量大；后一种方法的缺点是流程繁琐、耗时长。因此，迫切希望开发出新的APL相关融合基因的检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新的基于二代测序的APL相关融合基因检测方法、检测试剂盒，以及构建用于上述检测方法的二代测序DNA文库的方法、建库试剂盒。即，本专利技术包括：1.一种用于APL相关融合基因检测的二代测序DNA文库的构建方法，该方法包括：步骤A：将希望进行测序的cDNA进行末端修复，得到平末端DNA片段，该cDNA是由从人血液或骨髓样本中提取的总RNA反转录得到的；步骤B：将平末端DNA片段进行3'端加A，得到3'端加A的DNA片段；步骤C：将所述3'端加A的DNA片段进行加接头，得到加接头DNA片段；以及步骤D：将所述加接头DNA片段进行第一次PCR扩增，得到第一次扩增产物；步骤E：将所述第一次扩增产物进行巢式PCR扩增，得到第二次扩增产物；其中，所述步骤C中使用核苷酸序列如SEQIDNO:1所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQIDNO:2所示的单链DNA的退火产物作为所述接头；所述步骤D中使用核苷酸序列如SEQIDNO:51～62所示的单链DNA以及核苷酸序列如SEQIDNO:6所示的单链DNA作为PCR扩增引物；所述步骤E中使用核苷酸序列如SEQIDNO:31～42所示的单链DNA、核苷酸序列如SEQIDNO:4所示的单链DNA以及核苷酸序列如SEQIDNO:6所示的单链DNA作为PCR扩增引物。2.根据项1所述的方法，其中，在所述步骤A之前还包括下述步骤：从人血液或骨髓样本中提取的总RNA，并由该总RNA反转录得到cDNA第一链和cDNA第二链。3.根据项1所述的方法，其中，在所述步骤C与步骤D之间、步骤D与步骤E之间、和/或所述步骤E之后还包括对产物进行纯化的步骤。4.一种APL相关融合基因检测方法，该方法包括下述步骤：步骤A：将希望进行测序的cDNA进行末端修复，得到平末端DNA片段，该cDNA是由从人血液或骨髓样本中提取的总RNA反转录得到的；步骤B：将平末端DNA片段进行3'端加A，得到3'端加A的DNA片段；步骤C：将所述3'端加A的DNA片段进行加接头，得到加接头DNA片段；以及步骤D：将所述加接头DNA片段进行第一次PCR扩增，得到第一次扩增产物；步骤E：将所述第一次扩增产物进行巢式PCR扩增，得到第二次扩增产物；以及步骤F：对所述第二次扩增产物进行二代测序，并基于测序结果进行生物信息学分析；其中，所述步骤C中使用核苷酸序列如SEQIDNO:1所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQIDNO:2所示的单链DNA的退火产物作为所述接头；所述步骤D中使用核苷酸序列如SEQIDNO:51～62所示的单链DNA以及核苷酸序列如SEQIDNO:6所示的单链DNA作为PCR扩增引物；所述步骤E中使用核苷酸序列如SEQIDNO:31～42所示的单链DNA、核苷酸序列如SEQIDNO:4所示的单链DNA(index引物)以及核苷酸序列如SEQIDNO:6所示的单链DNA(公共引物)作为PCR扩增引物。5.根据项4所述的方法，其中，在所述步骤A之前还包括下述步骤：从人血液或骨髓样本中提取的总RNA，并由该总RNA反转录得到cDNA第一链和cDNA第二链。6.根据项4所述的方法，其中，在所述步骤C与步骤D之间、步骤D与步骤E之间、和/或所述步骤E之后还包括对产物进行纯化的步骤。7.根据项4所述的方法，其中，所述APL相关融合基因包括非典型APL中出现的PLZF-RARα、NuMA-RARα、NPM1-RARα、Stat5b-RARα、F1P1L1-RARα、PRKAR1A-RARα、BCOR-RARα和典型APL中出现的PML-RARα。8.一种用于APL相关融合基因检测的二代测序DNA文库构建的试剂盒，其包含用于二代测序DNA文库构建的试剂，所述用于二代测序DNA文库构建的试剂包含：核苷酸序列如SEQIDNO:1所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQIDNO:2所示的单链DNA，或者它们的退火产物；核苷酸序列如SEQIDNO:31～42所示的单链DNA；核苷酸序列如SEQIDNO:4所示的单链DNA；核苷酸序列如SEQIDNO:6所示的单链DNA；以及核苷酸序列如SEQIDNO:51～62所示的单链DNA。9.根据项8所述的试剂盒，其还包含用于从人血液或骨髓样本中提取的总RNA、并由该总RNA反转录得到cDNA第一链和cDNA第二链的试剂。10.根据项8所述的试剂盒，其中，所述用于构建二代DNA测序文库的试剂还包括选自下组中的至少一种或两种以上：T4DNA聚合酶、Klenow片段、Klenow缓冲液、DNA连接酶缓冲液、DNA连接酶、Taq酶、dNTP、T4多聚核苷酸激酶、以及T4多聚核苷酸激酶缓冲液。11.根据项9所述的试剂盒，其中，所述用于从人血液或骨髓样本中提取的总RNA、并由该总RNA反转录得到cDNA第一链和cDNA第二链的试剂包括选自下组中的至少一种或两种以上：Trizol试剂、氯仿、异丙醇、乙醇、无RNA酶的双蒸水、随机引物、反转录酶、反转录反应缓冲液、RNA酶抑制剂、dNTP、DNA聚合酶以及核糖核酸酶H。12.一种用于APL相关融合基因检测的试剂盒，其包含：用于构建二代测序DNA文库的试剂，以及用于对二代测序DNA文库进行上机测序的试剂；其中，所述用于构建二代测序DNA文库的试剂包含：核苷酸序列如SEQIDNO:1所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQIDNO:2所示的单链DNA，或者它们的退火产物；核苷酸序列如SEQIDNO:31～42所示的单链DNA；核苷酸序列如SEQIDNO:4所示的单链DNA；核苷酸序列如SEQIDNO:6所示的单链DNA；以及核苷酸序列如SEQIDNO:51～62所示的单链DNA。13.根据项12所述的试剂盒，其还包含用于从人血液或骨髓样本中提取的总RNA、并由该总RNA反转录得到cDNA第一链和cDNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于APL相关融合基因检测的二代测序DNA文库的构建方法，该方法包括：步骤A：将希望进行测序的cDNA进行末端修复，得到平末端DNA片段，该cDNA是由从人血液或骨髓样本中提取的总RNA反转录得到的；步骤B：将平末端DNA片段进行3'端加A，得到3'端加A的DNA片段；步骤C：将所述3'端加A的DNA片段进行加接头，得到加接头DNA片段；以及步骤D：将所述加接头DNA片段进行第一次PCR扩增，得到第一次扩增产物；步骤E：将所述第一次扩增产物进行巢式PCR扩增，得到第二次扩增产物；其中，所述步骤C中使用核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的单链DNA的退火产物作为所述接头；所述步骤D中使用核苷酸序列如SEQ ID NO:51～62所示的单链DNA以及核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的单链DNA作为PCR扩增引物；所述步骤E中使用核苷酸序列如SEQ ID NO:31～42所示的单链DNA、核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的单链DNA以及核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的单链DNA作为PCR扩增引物。

【技术特征摘要】
1.一种用于APL相关融合基因检测的二代测序DNA文库的构建方法，该方法包括：步骤A：将希望进行测序的cDNA进行末端修复，得到平末端DNA片段，该cDNA是由从人血液或骨髓样本中提取的总RNA反转录得到的；步骤B：将平末端DNA片段进行3'端加A，得到3'端加A的DNA片段；步骤C：将所述3'端加A的DNA片段进行加接头，得到加接头DNA片段；以及步骤D：将所述加接头DNA片段进行第一次PCR扩增，得到第一次扩增产物；步骤E：将所述第一次扩增产物进行巢式PCR扩增，得到第二次扩增产物；其中，所述步骤C中使用核苷酸序列如SEQIDNO:1所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQIDNO:2所示的单链DNA的退火产物作为所述接头；所述步骤D中使用核苷酸序列如SEQIDNO:51～62所示的单链DNA以及核苷酸序列如SEQIDNO:6所示的单链DNA作为PCR扩增引物；所述步骤E中使用核苷酸序列如SEQIDNO:31～42所示的单链DNA、核苷酸序列如SEQIDNO:4所示的单链DNA以及核苷酸序列如SEQIDNO:6所示的单链DNA作为PCR扩增引物。2.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述步骤A之前还包括下述步骤：从人血液或骨髓样本中提取的总RNA，并由该总RNA反转录得到cDNA第一链和cDNA第二链。3.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述步骤C与步骤D之间、步骤D与步骤E之间、和/或所述步骤E之后还包括对产物进行纯化的步骤。4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述APL相关融合基因包括非典型APL中出现的PLZF-RARα、NuMA-RARα、NPM1-RARα、Stat5b-RARα、F1P1L1-RARα、PRKAR1A-RARα、BCOR-RARα和典型APL中出现的PML-RARα。5.一种用于APL相关融合基因检测的二代测序DNA文库构建的试剂盒，其包含用于构建二代测序DNA文库的试剂，所述用于构建二代测序DNA文库的试剂包含：核苷酸序列如SEQIDNO:1所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQIDNO:2所示的单链DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：王秀莉，刘伟，玄兆伶，李大为，梁峻彬，陈重建，
申请(专利权)人：安诺优达基因科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11