本发明专利技术公开了检测白血病相关融合基因的引物、探针及试剂盒，其引物和探针是专门针对于BCR/ABL、PML/RARα、AML1/ETO和TEL/AML1融合基因共计8种型别特异性设计的。灵敏度高，特异性好。能够检出低至10拷贝的突变样本。本发明专利技术的试剂盒采用一步实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应法检测待检样本，其逆转录和定量PCR在同一反应体系中进行，只需一步荧光PCR扩增即可，反应过程中无需添加试剂，无需打开管盖，检测时间只需90分钟即可完成，操作非常简单。同时具备了灵敏度高，特异性好，廉价快速，操作简单等优点，具有较高的科研价值和临床应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
中分子生物学的基因检测，特别是涉及检测白血病相关 融合基因的引物、探针及试剂盒。
技术介绍
慢性粒细胞白血病（chronicmyelocyticleukemia,CML)是一种发生于造血干细 胞的血液系统恶性克隆增生性疾病。90%~95%的CML患者异常白细胞中可检测到含有一 段染色体易位形成的被命名为费城（Ph)染色体。Ph染色体形成机理为9号染色体的一段拼 接到了 22号染色体上，这种拼接形成了一个致癌性的融合基因BCR/ABI^BCR/ABL基因的编 码蛋白具有异常的酪氨酸酶活性，使调控细胞复制的信号传导途径一直处於活跃状态，从 而源源不断地产生更多的异常白细胞，骨髓正常控制的白细胞的生成被破坏，形成CML病 症。由于BCR基因断裂位点的不同，BCR/ABL融合基因呈现出不同的类型，并表达出不同的 BCR/ABL融合蛋白，常见的融合类型有ela2、b3a2(el4a2)、b2a2(el3a2)和el9a2。有研究 报道，不同的BCR/ABL融合基因亚型对白血病的危险度评估提供一定的指导价值。ela2型 BCR/ABL融合基因所表达的P190融合蛋白的酪氨酸激酶活性高于b2a2/b3a2型BCR/ABL融 合基因所表达的P210融合蛋白，因此其治疗方案也不同。及时检测患者白细胞中BCR/ABL 融合类型，对于CML的诊断、治疗方案及预后评估等提供直接的理论依据。 急性早幼粒细胞白血病（APL)是较为常见的急性髓细胞白血病的一种特殊类型， 98%以上的4?1^病人出现非随机的染色体易位七（15;17)&22^21)，造成？1^与狀1^基因 重排而形成PML/RARa融合基因。PML/RARa融合基因是由于15号染色体上的PML基因与位 于17号染色体上的RARa基因发生易位而形成并产生融合蛋白，该融合蛋白具有不同于正 常RARa等位基因编码的野生型维甲酸受体的功能，可阻断粒细胞的分化成熟，导致APL发 生。因此，PML/RARa融合基因在APL白血病的发生中起关键作用，同时也成为APL特异性 的分子标志。根据断裂点的不同所形成的PML/RARa融合基因相应的可分为长型（L)、短型 (S)和变异型（V)。通常PML/RARa融合基因L型出现在50%~60%的APL患者，S型出现 在20%~30%的APL患者，而V型则较为少见。研究发现L型APL患者通常对维甲酸的反 应性较好，而仅仅只有部分S型患者对维甲酸的反应性较好。因此，进行PML/RARa融合基 因以及亚型的检测，对于治疗方案选择以及疗效评估有一定的理论指导意义。 t(8 ;21) (q22, q22)易位最常见于儿童和年轻患者，很少见于60岁以上的患者， 约10%~20%的AML儿童患者。t (8 ;21)易位使8号染色体上ΕΤ0基因和21号染色体上 AML1基因形成AML1/ET0融合基因。美国国立综合癌症网络急性髓系白血病诊疗指南明确 指出：急性髓系白血病需要进行骨髓或者外周血中AML1-ET0融合基因的检测，并定期进行 监测。 t(12 ;21) (pl3 ;q22)易位常见儿童急性淋巴细胞白血病，导致12号染色体上TEL 基因与21号染色体上AML基因发生融合，最终形成TEL/AML1融合基因。研究表明，TEL/ AML1融合基因已被认为是急性白血病发病关键机制之一，属于白血病特异性分子标志物。 在临床研究中，急性淋巴细胞白血病患儿中TEL/AML1融合基因大多为阴性（20%~30% )， 即未发生TEL/AML1基因融合情况，且此类患儿临床总有效率并不理想（55. 26% )，而发生 TEL/AML1融合基因的急性淋巴细胞白血病患儿临床总有效率较高（80. 00% )，治疗效果较 为满意。因此，通过对急性淋巴细胞白血病患儿TEL/AML1基因融合情况进行检测，可准确 评估患儿临床疗效及预后，对临床医生制定针对性的治疗方案提供可靠依据，具有重要的 临床意义。目前检测融合基因的方法主要包括荧光原位杂交（FISH)、PCR和基因芯片等。但 这些方法存在着价格较为昂贵，操作步骤复杂，临床上广泛应用较为困难等问题。
技术实现思路
为解决现有技术中检测白血病相关融合基因的方法价格昂贵、操作繁琐复杂、临 床应用受限、检测灵敏度第等问题，本专利技术提供了一组检测白血病相关融合基因的引物和 探针。可以准确快速地检测鉴别BCR/ABL、PML/RARa、AML1/ET0和TEL/AML1共8种融合基 因型别（即前述融合基因的8中剪切异构体），检测成本低，临床适用范围广。 本专利技术还提供了包括上述检测白血病相关融合基因的引物和探针的试剂盒，可以 满足临床快速检测的实际需求。 本专利技术提供的检测白血病相关融合基因的引物和探针，其所述融合基因包括BCR/ ABL、PML/RARa、AML1/ET0和TEL/AML1，各融合基因型别检测的引物和TaqMan-探针的核苷 酸序列如下：上述引物和探针，能够准确快速地检测出BCR/ABL、PML/RARa、AML1/ET0和TEL/ AML1这四种常见白血病融合基因的8种剪切异构体，8种剪切异构体如下：BCR/ABL(ela2)、 BCR/ABL(el3a2)、BCR/ABL(el4a2)、BCR/ABL(el9a2)、PML/RARaL型、PML/RARaS型、AML1/ ETO和TEL/AML1。其中，TaqMan-探针的核苷酸序列的5'端标记有报告基团，3'端标记有 淬灭基团，这是TaqMan-探针的典型特点。 本专利技术提供的检测白血病相关融合基因的试剂盒，其包括以上所述的检测白血病 相关融合基因的引物和探针。 优选地，上述检测白血病相关融合基因的试剂盒中，所述TaqMan-探针的核苷酸 序列5'端标记的报告基团为FAM，3'端标记的淬灭基团为非荧光淬灭基团。3'端标记的淬 灭基团采用非荧光淬灭基团，优点是其本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度，有 利于增加检测灵敏度。 优选地，上述检测白血病相关融合基因的试剂盒中，所述TaqMan-探针为 TaqMan-MGB探针。 该试剂盒采用实时荧光定量PCR和TaqMan探针中MGB探针技术，TaqMan-MGB探 针上连接有MGB修饰基团，可以将探针的Tm值提高10°C左右，因此为了获得同样的Tm值， MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功 率大为提尚。 优选地，上述检测白血病相关融合基因的试剂盒中，还包括内参基因β-actin的 检测引物和TaqMan-MGB探针，其中检测引物的核苷酸序列如SEQIDN0:17~18所示， TaqMan-探针的核苷酸序列如SEQIDN0:19所示。增加内参基因的主要目的是方便检测以 及结果分析，降低样品污染等原因造成的结果失真，有利于提高检测灵敏度及特异性。理所 当然地，内参基因β -actin的TaqMan-探针报告基团应区别于上述检测白血病相关融合基 因的探针使用的报告基团。 优选地，上述检测白血病相关融合基因的试剂盒中，还包括阴性对照品：无菌无核 酸酶的ddH20,以及阳性对照品：8种型别融合基因的质粒混合物。所述8种型别融合本文档来自技高网...
【技术保护点】
检测白血病相关融合基因的引物和探针，其特征在于，所述融合基因包括BCR/ABL、PML/RARα、AML1/ETO和TEL/AML1，各融合基因型别检测的引物和TaqMan‑探针的核苷酸序列如下：。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王秀娟，李存耀，段卫涛，赵平锋，
申请(专利权)人：武汉海吉力生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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