本发明专利技术公开了一种用于现场快速检测副结核分支杆菌的引物和探针组合，其正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。本发明专利技术还公开了用于检测副结核分支杆菌的试剂盒。本发明专利技术提供的副结核分支杆菌RPA‑nfo检测引物与探针组合以及试剂盒灵敏度高、特异性强，最低可以检测到8拷贝/反应的副结核分支杆菌DNA。无需特殊仪器设备，借助恒温水浴锅或人体腋窝温度，25min就能对待测样本的粗裂解物进行副结核分支杆菌DNA的灵敏、特异、快速地检测，适合现场或基层副结核病的诊断工作。
【技术实现步骤摘要】
用于现场快速检测副结核分支杆菌的引物、探针及试剂盒
本专利技术涉及微生物检测
，具体涉及一种应用重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条技术，现场快速检测副结核分支杆菌的引物、探针及试剂盒。
技术介绍
副结核病，也称副结核性肠炎，是由副结核分枝杆菌(Mycobacteriumparatuberculosis，MAP)引起牛、羊、鹿以及骆驼等多种动物的一种慢性传染病。OIE将其列为B类疫病，我国将其列为多种动物共患的二类动物疫病。副结核分支杆菌主要感染牛、羊和鹿，发病动物和隐性感染者是主要传染源，它们可通过乳汁、粪便和尿排出大量的病原菌。本病的流行特点是发展缓慢，发病率不高，病死率极高，并且一旦在动物群中出现则很难根除。近年来我国养殖场副结核病的感染率有上升的趋势，一些养殖场依然没有重视该病的防控。由于副结核病引起患病动物消瘦、生产性能下降、增加饲料消耗及易感染其他疾病直至死亡，给养殖业造成的经济损失相当严重，因此，规模化牧场副结核病的检疫与净化显得非常重要。目前，副结核病的诊断方法主要有病原学方法、变态反应和血清学方法，其中，病原学主要有萋-尼氏抗酸染色、分离培养、PCR技术、LAMP快速检测等。对于萋-尼氏抗酸染色而言，由于粪便样品中可能还有其他的抗酸菌，会干扰染色法的诊断结果；对于分离培养法而言，分离培养耗时费工，分离率也较低；PCR技术对仪器设备和技术人员依赖程度高，在基层条件差和技术人员匮乏的情况下，很难实现现场实地快速诊断；LAMP快速检测虽然可以进行核酸的恒等温扩增，但仍不能对核酸粗提物的DNA样本进行直接扩增。此外，现有的采用PCR和LAMP诊断副结核病的报道中，其设计引物所依据的保守基因序列有多种，有的以副结核分枝杆菌ISMav2基因(AF286339)的保守区域设计引物(“牛副结核分支杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立”，中国畜牧兽医，2012年第39卷第10期)；有的以牛副结核分枝杆菌的IS900基因序列作为靶基因设计特异性引物(“牛副结核分枝杆菌LAMP快速检测方法的建立”，中国预防兽医学报，2012年6月)，而根据不同的靶标(保守基因)设计的引物序列不同，对副结核分枝杆菌的诊断和检测效果也存在较大差异，因此，选择何种靶标作为引物设计的依据也是病原学法诊断副结核分枝杆菌的难点之一。皮内变态反应能检测出副结核感染前期的大部分发病动物，但对于感染中后期以及处于耐受期的动物敏感性不强或者不出现反应状态。动物在感染副结核分枝杆菌后的前期并不产生抗体，只有在临床症状阶段才产生抗体，所以使用血清学方法可能漏检副结核病阳性动物。因此，从临床诊断的时效性方面考虑，亟需一种新的病原学现场快速恒等温扩增检测技术。重组酶聚合酶扩增(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)技术是目前新出现的一种体外快速核酸扩增技术，在37℃左右就能发生反应，并且仅需十几分钟就能扩增出痕量级的检测产物。同时RPA可以完成核酸粗提物的扩增，它通过琼脂糖凝胶电泳，荧光扩增曲线和侧流层析试纸条(LateralFlowDipstick，LFD)三种方式检测结果，这三种方式的引物与探针反应原理是不同的。基本的RPA扩增只需上下游引物，产物通过凝胶电泳检测，而RPA-nfo和RPA-exo反应，是通过不同的探针结合到模板互补链后再通过核酸内切酶IV(nfo)和核酸内切酶III(exo)切割掉3'端阻止序列，这两种方法分别通过LFD(nfo)和实时荧光(exo)两种不同的手段检测结果。凝胶电泳和荧光扩增曲线法仍然依赖实验室和特殊仪器设备，而LFD是一种无需特殊仪器可用于现场的检测方法。将RPA技术与LFD技术结合，通过LFD读取结果，既不要求特殊仪器设备，也无需复杂的样品处理，借助恒温水浴锅用LFD就可以通过肉眼观察结果。但目前尚无文献报道利用RPA-LFD技术现场检测副结核分枝杆菌。但RPA技术属于新兴的核酸扩增技术，其应用并不十分普遍，其主要技术难点在于特异性引物和探针的设计和筛选，而引物/探针的设计和选择对RPA-nfo的结果是至关重要的，目前并没有像PCR扩增技术那样专门的引物/探针的设计软件，也没有较多的文献和试验数据提供技术依据。经相关检索，目前还未有针对副结核分枝杆菌进行RPA-LFD检测的相关报道。综上，对于副结核分枝杆菌的RPA-LFD检测，目前尚无明确可借鉴的思路和结果，还需要技术人员做大量和深入的研究。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种用于现场快速检测副结核分支杆菌的引物、探针及试剂盒。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种用于现场快速检测副结核分支杆菌的引物和探针组合，包括RPA-nfo正向引物、反向引物和RPA-nfo探针；其RPA-nfo正向引物序列如SEQIDNO.1所示，反向引物序列如SEQIDNO.2所示，其RPA-nfo探针序列如SEQIDNO.3所示。具体序列如下：正向引物：5'-TCGTCGTTGGCCACCCGCTGCGAGAGCAAT-3'；(SEQIDNO.1)反向引物：5'-(Biotin)ACTCGACCGCTAATTGAGAGATGCGATTG-3'；(SEQIDNO.2)探针：5'-(FAM)CCACAACCACCTCCGTAACCGTCATTGTC(dSpacer)AGATCAACCCAGCAGAC(C3-Spacer)-3'(SEQIDNO.3)。本专利技术的探针，在其5'端用FAM标记，距离5'端30个碱基左右的位置处用dSpacer替代一个碱基，3’端用C3-spacer阻断。需要说明的是，与常规PCR反应不同，RPA-nfo反应所需引物的长度通常为30～35bp，引物过短会严重影响重组酶的活性；但长引物也并不一定能提高扩增性能，反而还会增加形成二级结构的可能性。LF探针长度一般在46～52bp，nfo核酶距离探针5'端30个碱基左右，距离3'端16～22个碱基左右，个别碱基的替换或增减都会对探针的特异性产生影响。因此，引物的设计和选择对RPA的结果至关重要。RPA技术正处于起步研究阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其引物设计原则提供依据。因此，本专利技术的引物和探针组合是需要从靶标序列两端设计多对引物和探针组合，然后进行试验优化、筛选才能得到。本专利技术设计了多组不同的引物和探针组合，经试验反复验证后，确定本专利技术所列出的上述引物和探针组合，其检测效果最佳。本专利技术的第二方面，提供一种用于现场快速检测副结核分支杆菌的试剂盒，该试剂盒中包含上述的引物和探针组合。进一步的，该试剂盒中还包括：阳性质控标准品、阴性质控标准品和RPA-nfo反应液。所述阳性质控标准品为：包括副结核分支杆菌IS900基因片段的阳性质控标准品；优选的，所述副结核分支杆菌IS900基因片段阳性质控标准品由含有259个碱基的核苷酸片段构成的pEASY-T3重组质粒组成；所述含有259个碱基的核苷酸片段的序列如SEQIDNO.4所示，具体如下：5'-ATCAGCGCGGCACGGCTCTTGTTGTAGTCGAAGGCGCGTTCCAGCGCCGAAAGTATTCCAGCAGCTGGGCGCGCATTCGGTT本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于现场快速检测副结核分支杆菌的引物和探针组合，包括RPA‑nfo正向引物、反向引物和RPA‑nfo探针，其特征在于，所述RPA‑nfo正向引物、反向引物和RPA‑nfo探针的序列如下所示：正向引物：5'‑TCGTCGTTGGCCACCCGCTGCGAGAGCAAT‑3'；(SEQ ID NO.1)反向引物：5'‑(Biotin)ACTCGACCGCTAATTGAGAGATGCGATTG‑3'；(SEQ ID NO.2)探针：5'‑(FAM)CCACAACCACCTCCGTAACCGTCATTGTC(dSpacer)AGATCAACCCAGCAGAC(C3‑Spacer)‑3'(SEQ ID NO.3)。
【技术特征摘要】
1.一种用于现场快速检测副结核分支杆菌的引物和探针组合，包括RPA-nfo正向引物、反向引物和RPA-nfo探针，其特征在于，所述RPA-nfo正向引物、反向引物和RPA-nfo探针的序列如下所示：正向引物：5'-TCGTCGTTGGCCACCCGCTGCGAGAGCAAT-3'；(SEQIDNO.1)反向引物：5'-(Biotin)ACTCGACCGCTAATTGAGAGATGCGATTG-3'；(SEQIDNO.2)探针：5'-(FAM)CCACAACCACCTCCGTAACCGTCATTGTC(dSpacer)AGATCAACCCAGCAGAC(C3-Spacer)-3'(SEQIDNO.3)。2.权利要求1所述的引物和探针组合在制备副结核分支杆菌检测的试剂盒、芯片和/或扩增反应试剂中的用途。3.一种检测副结核分支杆菌的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含权利要求1所述的引物和探针组合。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒中还包括有：阳性质控标准品、阴性质控标准品和RPA-nfo反应液。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控标准品为包括副结核分支杆菌IS900基因片段的阳性质控标准品；优选的，所述副结核分支杆菌IS900基因片段阳性质控标准品由含有259个碱基的核苷酸片段构成的pEASY-T3重组质粒组成；所述含有259个碱基的核苷酸片段的序列如SEQIDNo.4所示。6.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性质控标准品为pEASY-T3空载质粒。7.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：何洪彬，赵贵民，王洪梅，侯佩莉，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：山东,37
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