一种检测结核分支杆菌耐药性的DNA标记物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测结核分支杆菌耐药性的DNA标记物及其应用，本发明专利技术发现突变蛋白Rv2783cD67N具有不依赖DNA模板的DNA聚合酶活性且不受POA抑制；还具有磷酸解单链DNA（SS DNA）活性；且突变蛋白Rv2783cD67N不与POA结合；这样的位点突变会显著引起结核分枝杆菌对PZA的耐药性，可作为结核分枝杆菌PZA耐药性分子诊断的一个标志位点，有利于提高对具有PZA耐药性的结核分枝杆菌的检出率，精准率。能够有效缩短患者的诊断时间，节约患者治疗时间和费用。该发明专利技术为找到新的、更有效的结核病耐药分子标识物提供了一种新的思路。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测结核分支杆菌耐药性的DNA标记物及其应用。
技术介绍
吡嗪酰胺（PZA）是一线抗结核药物，其作用机制还没有被完全阐明。目前只是知道，PZA是一种前药，需要被结核分枝杆菌（Mtb）的吡嗪酰胺酶（PZase）活化成活性形式POA才起作用。因此，PZase的基因pncA突变可以导致Mtb对PZA耐药[1]，故pncA可以作为快速诊断Mtb对PZA是否耐药的重要DNA分子标记，并已被广泛证明。但是，有相当多的对PZA耐药的Mtb并没有pncA基因突变，因此，推测是其活性产物POA的靶标发生了突变，故而导致耐药。最近先后有报道称编码核糖体蛋白S1的rpsA基因[2]以及编码天冬氨酸脱羧酶的panD基因[3,4]与PZA的耐药性有关。然而，在实际研究中发现，有些PZA耐药的临床Mtb菌株并不存在已知的pncA，rpsA和panD基因突变，这些临床Mtb菌株的PZA耐药机制如何？怎么才能更便利地被检测出，提高结核分枝杆菌PZA耐药的检出率？仍是目前所面临的难题。参考文献：1. A. Scorpio, Y. Zhang, Mutations in pncA, a gene encoding pyrazinamidase/nicotinamidase, cause resistance to the antituberculous drug pyrazinamide in tubercle bacillus. Nat. Med. 2, 662-667 (1996).2. W. Shi, X. Zhang, X. Jiang, H. Yuan, J. S. Lee, C. E. Barry, H. Wang. W. Zhang, Y. Zhang, Pyrazinamide inhibits trans-translation in Mycobacterium tuberculosis. Science333, 1630-1632 (20110.3.W. Shi, J. Chen, J. Feng, P. Cui, S. Zhang, X. Weng, W. Zhang, Y. Zhang, Aspartate decarboxylase (PanD) as a new target of pyrazinamide in Mycobacterium tuberculosis. Emerg Microbes Infect3, e58 (2014).4. N.A. Dillon, N. D. Peterson, B. C. Rosen, A. D. Baughn, Pantothenate and pantetheine ntagonize the antitubercular activity of pyrazinamide. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 7258-63 (2014)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的检测位点及其应用。本专利技术所采取的技术方案是：一种检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的方法，检测结核分枝杆菌蛋白Rv2783c第67位氨基酸天冬氨酸Asp是否突变为天冬酰胺Asn。一种检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的方法，检测结核分枝杆菌基因Rv2783c的第199位碱基是否发生G突变为A的碱基突变。一种检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的检测试剂盒，该试剂盒含有用于检测基因Rv2783c第199位碱基G是否突变为A的特异性寡核苷酸探针。一种检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的检测膜，该检测膜中含有用于检测基因Rv2783c第199位碱基G是否突变为A的特异性寡核苷酸探针。一种检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的检测试剂盒，该试剂盒含有用于检测基因Rv2783c第199位碱基G是否突变为A的PCR扩增引物。进一步的，所述引物序列为：Rv2783cF：5’-GGGAATTCCATATGTCTGCCGCTGAAAT-3’ （SEQ ID NO：5）；Rv2783cR：5’-CCCAAGCTTATTCGGTGACCACTCG-3’ （SEQ ID NO：6）。一种吡嗪酰胺耐药结核分枝杆菌的蛋白，该蛋白为突变的蛋白Rv2783c，突变位点为第67位氨基酸天冬氨酸Asp突变为天冬酰胺Asn。进一步的，上述蛋白具有不依赖DNA模板的DNA聚合酶活性，且其活性不受吡嗪酸的影响。进一步的，上述蛋白具有磷酸解单链DNA的活性。一种吡嗪酰胺耐药结核分枝杆菌的碱基序列，该序列为突变的基因Rv2783c序列，突变的位点为第199位碱基由G突变为A。本专利技术的有益效果是：1）本专利技术发现了Rv2783c基因特定位点的突变会显著引起结核分枝杆菌对PZA的耐药性，PZA对该突变结核分枝杆菌的MIC（最小抑菌浓度）达500 µg/ml；可作为结核分枝杆菌PZA耐药性分子诊断的一个标志位点，有利于提高对具有PZA耐药性的结核分枝杆菌的检出率，精准率。能够有效缩短患者的诊断时间，节约患者治疗时间和费用。该专利技术为找到新的、更有效的结核病耐药分子标识物提供了一种新的思路。2）本专利技术通过研究发现，突变蛋白Rv2783cD67N具有不依赖DNA模板的DNA聚合酶活性且不受POA抑制；还具有磷酸解单链DNA（SS DNA）活性；且突变蛋白Rv2783cD67N不与POA结合；这对进一步研究出抗PZA耐药结核分枝杆菌药物提供的广泛的新的思路。附图说明图1为野生型Rv2783c与POA、PZA相互作用的检测结果；(A)等温滴定(Isothermal titration calorimetry, ITC)结合研究表明，较高浓度的POA可以与结核菌的野生型Rv2783c结合。上半部分显示的是原始数据，Y轴表示野生型Rv2783c与POA结合时每秒释放的热量；下半部分显示的是每注射一次POA释放的热量以及拟合的曲线，Y轴表示每次注射每摩尔释放的热量；(B)ITC结合研究显示，PZA不结合野生型Rv2783c，上半部分Y轴显示的是，PZA与野生型Rv2783c不结合，不放出热量，而下半部分显示的是每次注入PZA都没有热量放出，因而没有拟合曲线；图2为毛细管电泳结果显示Rv2783c具有不依赖模板的DNA合成活性；(A)未抑制的野生型 Rv2783c DNA合成活性；(B)PZA不抑制野生型Rv2783c DNA合成活性；(C) POA抑制野生型Rv2783c的DNA合成活性；(D)比较POA和PZA对野生型Rv2783c的不依赖DNA模板的DNA聚合酶活性抑制效果；(E)突变的Rv2783cD67N的DNA聚合酶活性既不受PZA影响，（G）也不受POA的影响；(H)比较POA和PZA对突变的Rv2783cD67N的不依赖DNA模板的DNA聚合酶活性抑制效果。数据显示的是平均值± SEM。使用t-test进行统计学分析；图3为毛细管电泳结果显示Rv2783c磷酸解单链DNA（SS DNA）的活性；(A)未抑制的野生型Rv2783c 磷酸解活性；(B) PZA不抑制野生型Rv2783c 磷酸解；(C) POA抑制野生型Rv2783c的磷酸解活性；(D) 比较POA和PZA对野生型Rv278本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的方法，其特征在于，检测结核分枝杆菌蛋白Rv2783c第67位氨基酸天冬氨酸Asp是否突变为天冬酰胺Asn。

【技术特征摘要】
1.一种检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的方法，其特征在于，检测结核分枝杆菌蛋白Rv2783c第67位氨基酸天冬氨酸Asp是否突变为天冬酰胺Asn。2.一种检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的方法，其特征在于，检测结核分枝杆菌基因Rv2783c的第199位碱基是否发生G突变为A的碱基突变。3.一种检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有用于检测基因Rv2783c第199位碱基G是否突变为A的特异性寡核苷酸探针。4.一种检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的检测膜，其特征在于：该检测膜中含有用于检测基因Rv2783c第199位碱基G是否突变为A的特异性寡核苷酸探针。5.一种检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有用于检测基因Rv2783c第199位碱基G是否突变为A的PCR扩增引物。6.根据权利要求5...

【专利技术属性】
技术研发人员：张天宇，摩西·M·恩扎瑞，王邦兴，刘燕，刘洋，刘志永，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44