用于鉴定坛紫菜优质品系Q‑1的分子标记及其构建方法，涉及坛紫菜。构建方法：1)收集坛紫菜材料；2)提取总DNA：将步骤1)收集的叶状体材料在液氮中研磨成粉末，采用CTAB法提取总DNA；3)RAPD扫描分析：采用RAPD引物对步骤2)中获得的各材料总DNA进行标记扫描分析；4)RAPD扩增产物的电泳检测；5)特异性条带的切胶回收、测序；6)SCAR标记引物设计：根据两个标记的核苷酸序列，设计SCAR标记的引物序列；7)SCAR标记的验证；8)PCR扩增产物的电泳检测：若能分别检测到一条长度为328bp和389bp的特异性片段，则属于坛紫菜优质品系Q‑1，否则不属于。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及坛紫菜，尤其是涉及一种坛紫菜优质品系Q-1鉴定的分子标记构建方法及其应用。
技术介绍
坛紫菜(Porphyra haitanensis)是我国特有的暖温带性品种，是浙江南部、福建和广东北部沿海人工养殖的重要经济红藻，其产量约占全国紫菜总产量的80％。近年来，虽然坛紫菜养殖面积不断扩大，但由于品种的提纯、复壮、种质改良等研究工作相对滞后，主要栽培品种仍为未经选育的野生种，广大养殖户仍以传统方式进行生产，种菜自养自留，生产技术落后等原因，造成坛紫菜种质严重退化，产量降低、质量下降、抗逆能力减弱，烂苗和病害经常发生，严重影响了沿海渔民的经济收入和坛紫菜养殖业的健康持续发展。因此，在生产上开展坛紫菜的遗传育种研究，选育出具有明显抗逆性状的优质品系对于保证我国坛紫菜产业的稳定发展已显得十分迫切和重要。最近几年，坛紫菜新品系的选育已经取得了一定进展，国内的紫菜工作者选育出多个坛紫菜新品系，并在生产上推广应用。陈昌生等(陈昌生，徐燕，纪德华，谢潮添，王玉，王凤霞，柳佩娟.坛紫菜品系间杂交藻体选育及经济性状的初步研究.水产学报，2007，31(1)：97-104；梁艳，徐燕，陈昌生，纪德华，谢潮添，史修周，王凤霞，赵玲敏.坛紫菜优质新品系(Q-1)主要经济性状的研究.渔业科学进展，2009，30(4)：108-116)报导了坛紫菜优质品系Q-1的选育和经济性状，随后在生产上开展Q-1品系的大面积中试应用，其稳定的优质性状得到了规模化生产的验证。但由于优质品系Q-1在形态上与其它坛紫菜品系没有明显区别，可用于鉴别的形态性状非常有限，在生产上经常造成种质混淆，不利于坛紫菜良种的推广和知识产权的保护。分子标记技术的出现给这一问题的解决带来了契机，它直接在DNA水平上标记检测基因组的遗传变异，不受发育时期和环境因素的影响，已经广泛应用于高等植物的种质鉴定中。SCAR标记是一种以常规PCR扩增为基础的分子标记技术，具有结果稳定、重复性好、操作简便、可以快速检测大量个体、检测费用低等优点，被认为是种质鉴定的最佳分子标记技术。但由于该标记技术需要预先知道目的片段的两端序列，并根据标记两端序列设计特异引物，因此现在一般采用对AFLP标记和RAPD标记进行克隆、测序后转换得到SCAR标记的方法来开发。目前SCAR标记已经在陆生高等植物的种质鉴定中得到了广泛的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种快速、准确的用于鉴定坛紫菜优质品系Q-1的分子标记及其构建方法。所述用于鉴定坛紫菜优质品系Q-1的分子标记的核苷酸序列如下：Q1-500：Q1-650：所述Q1-500的特征引物序列为：正向引物：5’-ACTAAACCAATCTTATCCAATG-3’；反向引物：5’-GAGCTAATCCCTAAAAACCGTC-3’。所述Q1-650的特征引物序列为：正向引物：5’-GTTTACCCCTACCCTGACGAG-3’，反向引物：5’-TTTGAGGCATTTGAAGTTCTT-3’。所述用于鉴定坛紫菜优质品系Q-1的分子标记的构建方法，包括以下步骤：1)收集坛紫菜材料；在步骤1)中，所述收集坛紫菜材料，可收集坛紫菜优质品系Q-1和福建省坛紫菜种质资源库保存的坛紫菜其它品系新鲜健康叶状体材料，用无菌海水处理后，备用。2)提取总DNA：将步骤1)收集的叶状体材料在液氮中研磨成粉末，采用CTAB法提取总DNA。3)RAPD扫描分析：采用RAPD引物对步骤2)中获得的各材料总DNA进行标记扫描分析，RAPD扩增的反应体系为：10×PCR buffer 2.0μL，2.5mM dNTP 1.0μL，10μM RAPD引物1.0μL，25mM MgCl2 1.0μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.3μL，5ng/μL模板DNA 2.0μL，最后加无菌ddH2O至反应体系总体积为25μL。RAPD扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，37℃复性50s，72℃延伸1min，以上3步重复40个循环；72℃延伸10min；4)RAPD扩增产物的电泳检测：取7μL RAPD扩增产物，加3μL溴酚蓝后于1.2％的琼脂糖凝胶中电泳1.5h后，在紫外灯下观察电泳结果，在引物S241的RAPD扩增结果中找到一条长度约为500bp的特异性条带(只有优质品系Q-1中有，其它品系没有的条带，命名为Q1-500)；在引物S243的RAPD扩增结果中同样找到一条长度约为650bp的特异性条带(命名为Q1-650)；所述引物S241的序列为：5’-ACGGACGTCA-3’；所述引物S243的序列为：5’-CTATGCCGAC-3’；5)特异性条带的切胶回收、测序：将步骤4)中获得的两条特异性条带Q1-500和Q1-650切胶回收后进行测序，分别获得的核苷酸序列如下：Q1-500：Q1-650：6)SCAR标记引物设计：根据步骤5)中获得的两个标记的核苷酸序列，用Primer 5.0软件设计SCAR标记的引物序列，标记Q1-500的特征引物序列为：正向引物：5’-ACTAAACCAATCTTATCCAATG-3’；反向引物：5’-GAGCTAATCCCTAAAAACCGTC-3’；扩增的片段长度为328bp，PCR扩增时退火温度为56℃；标记Q1-650的特征引物序列为：正向引物：5’-GTTTACCCCTACCCTGACGAG-3’；反向引物：5’-TTTGAGGCATTTGAAGTTCTT-3’；扩增的片段长度为389bp，PCR扩增时退火温度为57.5℃；7)SCAR标记的验证：分别应用所设计的两对SCAR标记引物对对步骤2)中获得的各材料总DNA进行PCR扩增，PCR扩增反应体系为：10×PCR buffer 2.0μL,2.5mM dNTP 1.0μL，10μM SCAR正反向引物各0.5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.3μL，5ng/μL总DNA 2.0μL，最后加无菌ddH2O至反应体系总体积为25μL。PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃(Q1-500)或57.5℃(Q1-650)复性50s，72℃延伸1min，以上3步重复30个循环；72℃延伸10min。8)PCR扩增产物的电泳检测：取7μLPCR扩增产物，加3μL溴酚蓝后于1.2％的琼脂糖凝胶中电泳1.5h后拍照记录，若能分别检测到一条长度为328bp和389bp的特异性片段，则该叶状体材料属于坛紫菜优质品系Q-1，否则不属于。本专利技术应用RAPD分子标记技术对紫菜材料进行遗传分析，获得坛紫菜优质品系Q-1的特异性扩增片段；所述特异性片段经大量扩增后回收、克隆、测序得到坛紫菜优质品系Q-1的特异性扩增片段Q1-500和Q1-650的碱基序列；再根据这两个扩增片段的碱基序列合成特异引物对，经PCR反应程序，将所述特异性扩增片段转换成SCAR标记。本专利技术的SCAR标记可以作为坛紫菜优质品系Q-1的种质鉴定和知识产权保护的分子标记。其紫菜种质检测结果稳定，操作快捷，重复性、稳定性高，检测费用低，省时省力。同样适合于把其它类型的标记(如AFLP，RFLP，SRAP)转换为SCAR标记。本专利技术具有如下优点：(1)本专利技术采用本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于鉴定坛紫菜优质品系Q‑1的分子标记，其特征在于其核苷酸序列如下：Q1‑500：Q1‑650：
【技术特征摘要】
1.用于鉴定坛紫菜优质品系Q-1的分子标记，其特征在于其核苷酸序列如下：Q1-500：Q1-650：2.如权利要求1所述用于鉴定坛紫菜优质品系Q-1的分子标记，其特征在于所述Q1-500的特征引物序列为：正向引物：5’-ACTAAACCAATCTTATCCAATG-3’；反向引物：5’-GAGCTAATCCCTAAAAACCGTC-3’；所述Q1-650的特征引物序列为：正向引物：5’-GTTTACCCCTACCCTGACGAG-3’，反向引物：5’-TTTGAGGCATTTGAAGTTCTT-3’。3.用于鉴定坛紫菜优质品系Q-1的分子标记的构建方法，其特征在于包括以下步骤：1)收集坛紫菜材料；2)提取总DNA：将步骤1)收集的叶状体材料在液氮中研磨成粉末，采用CTAB法提取总DNA；3)RAPD扫描分析：采用RAPD引物对步骤2)中获得的各材料总DNA进行标记扫描分析，RAPD扩增的反应体系为：10×PCR buffer 2.0μL，2.5mM dNTP 1.0μL，10μM RAPD引物1.0μL，25mM MgCl2 1.0μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.3μL，5ng/μL模板DNA2.0μL，最后加无菌ddH2O至反应体系总体积为25μL。RAPD扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，37℃复性50s，72℃延伸1min，以上3步重复40个循环；72℃延伸10min；4)RAPD扩增产物的电泳检测：取7μL RAPD扩增产物，加3μL溴酚蓝后于1.2％的琼脂糖凝胶中电泳1.5h后，在紫外灯下观察电泳结果，在引物S241的RAPD扩增结果中找到一条长度约为500bp的特异性条带，命名为Q1-500；在引物S243的RAPD扩增结果中同样找到一条长度约为650bp的特异性条带，命名为Q1-650；所述引物S241的序列为：5’-ACGGACGTCA-3’；所述引物S243的序列为：5’-CTATGCCGAC-3’；5)特异性条带的切胶回收、测序：将步骤4)...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢潮添，陈昌生，纪德华，徐燕，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
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