本发明专利技术公开了一种用于诱导外周血单个核细胞产生细胞因子的结核分支杆菌融合蛋白。本发明专利技术的融合蛋白，包含CFP-10、EsxG和EsxH三个蛋白，蛋白之间通过连接肽连接。本发明专利技术提供的融合蛋白与现有的刺激物相比，其作用更高效、敏感性更强、特异性更高、刺激效果好。同时，本发明专利技术融合蛋白刺激PBMC产生大量结核杆菌抗原特异性的IFN-γ、IL-2、TNF-α等结核相关因子，且这一刺激诱导反应不受卡介苗的干扰。本发明专利技术将更有效的提高结核病的检出率，对结核病的控制具有积极的意义。本发明专利技术的融合蛋白作为刺激物，可应用于结核病致病及免疫预防机制的研究，以及进一步的对结核病的控制中。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学技术中的蛋白领域，具体涉及一种用于诱导外周血单个核细胞产生细胞因子的结核分支杆菌融合蛋白。
技术介绍
结核病(tuberculosis, TB)是一种由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，可侵及许多脏器，以肺部结核感染最为常见。全世界约有1/3的人口感染结核杆菌，每年新发结核病人约900万，每年约有300万人死于结核病，结核病已成为全世界成人因传染病而死亡的主要疾病之一。根据世卫组织2014年10月22日出版的《2014年全球结核病报告》显示，2013年有900万人染上结核病，150万人死亡，约95%的结核病死亡发生在低收入和中等收入国家。中国是全球22个结核病高负担国家之一，活动性肺结核病人数居世界第二位。结核病的传染主要是发生在病人未被发现并进行治疗之前，I名结核病患者平均可传染15人。因为在未发现患病前，新发病人没有采取任何预防手段，在与家庭成员、同事、同学等密切接触的过程中，接触者就容易被结核菌感染。结核分枝杆菌是一种典型的胞内感染菌，人体对其免疫机制主要是以T细胞为主的细胞免疫。结核分枝杆菌侵入呼吸道后，原肺泡中未活化的树突状细胞(Dendriticcells, DC)抗菌活性弱，不能防止所吞.的结核分枝杆菌生长，但可将结核分枝杆菌吞.并带到他处，提呈抗原，使周围T淋巴细胞致敏，致敏的T淋巴细胞可产生多种细胞因子(INF-γ、IL-2与TNF-α等)，这些细胞因子共同作用，杀死病灶中的结核分枝杆菌。根据这一免疫机制，通过对已感染结核分枝杆菌的患者及健康人血液中的细胞因子进行分析对比，发现感染结核分枝杆菌的患者其血液中INF- γ、IL-2、TNF-α的浓度明显升高。对于已经感染了结核分支杆菌的患者，当已经过免疫的的特异性淋巴细胞在再次接触结核杆菌时，仍然会分泌相应的细胞因子。为研究结核分枝杆菌的致病机制及免疫机制，研究人员使用体外诱导PBMC产生结核相关细胞因子的方式。外周血是人类免疫系统研究的主要对象，其中体外诱导外周血单个核细胞PBMC包括淋巴细胞(Τ淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞)、单核细胞和树突状细胞。将已经感染了结核分枝杆菌的患者的外周血采出，提取其中的PBMC，并采用结核相关抗原对其进行刺激，PMBC即可对抗原发生免疫反应，产生相应的细胞因子。由于直接使用结核分枝杆菌进行实验具有相当的危险性，不利于进行大量研究，因此研究人员采用提取的结核分枝杆菌抗原蛋白进行研究实验。结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)是从结核分枝杆菌培养滤液中获得的活性物质，其主要成分是蛋白质。pro可以刺激T细胞产生IFN-γ、IL-2等细胞因子，但对于已经经过卡介苗(BCG)免疫个体的样本，PPD同样能够刺激其提取出来的PBMC产生结核相关细胞因子，因此PPD的特异性较低，还需寻找特异性更好的刺激物。
技术实现思路
为了解决上述问题，寻找特异性更好的刺激物，本专利技术的目的在于提供一种用于诱导外周血单个核细胞产生结核相关细胞因子的融合蛋白以及应用。本专利技术所采取的技术方案是: 一种融合蛋白，包含CFP-10、EsxG和EsxH三个蛋白，蛋白之间通过连接肽连接。优选的，连接肽氨基酸序列为GGGGSGGGSGGSGS (SEQ ID NO:3)。优选的，CFP_10、EsxG和EsxH蛋白为全序列蛋白或表达抗原活性的部分功能区域多肽。优选的，该融合蛋白为CFP-10-连接肽-EsxG-连接肽-EsxH、CFP-1O-连接肽-EsxH-连接肽_EsxG、EsxG_连接肽-CFPlO-连接肽-EsxH、EsxG-连接肽-EsxH -连接肽-CFP10、EsxH-连接肽-CFP-10-连接肽-EsxG或者EsxH-连接肽-EsxG-连接肽-CFP-10。优选的，该融合蛋白为CFP-10-连接肽-EsxG-连接肽-EsxH。优选的，融合蛋白CFP-10-连接肽-EsxG-连接肽-EsxH的氨基酸序列如SEQ IDNO: I所示ο优选的，编码融合蛋白CFP-10-连接肽-EsxG-连接肽-EsxH的核酸序列如SEQ IDNO:2所示。上述任一项所述的融合蛋白能够诱导外周血单个核细胞产生结核相关细胞因子的融合蛋白。上述任一项所述的融合蛋白作为结核病检测抗原的应用。上述任一项所述的融合蛋白在结核病预防治疗中作为刺激物的应用。本专利技术的有益效果是: I)本专利技术提供了一种可以刺激PBMC产生结核相关细胞因子的融合蛋白，与现有的刺激物相比，其作用更高效、敏感性更强、特异性更高、刺激效果好。在本专利技术融合蛋白的作用下，PBMC可高效产生结核杆菌抗原特异性的IFN-γ、IL-2、TNF-α等结核相关因子，并且这一刺激诱导反应不受BCG (卡介苗)的干扰。2)本专利技术选用的连接肽链为经过设计、筛选的可以显著提高融合蛋白活性的短肽。目前蛋白领域研究中常用的连接肽主要有(Gly4Ser) 3，而本专利技术所采用的连接肽氨基酸序列为GGGGSGGGSGGSGS，使得CFP-10-EsxG-EsxH融合蛋白中各自蛋白的空间构象及活性得到更好的实现，与混合肽、或其他融合蛋白相比，本专利技术融合蛋白的特异性及诱导效果具有明显的进步。本专利技术提供的融合蛋白对结核病致病及免疫预防机制的研究有重要意义，从而对结核病的控制具有积极的意义。【附图说明】图1为ELISA检测各组中PBMC在融合蛋白CFP-10-EsxG-EsxH作用下分泌细胞因子IL-2的情况； 图2为ELISP0T检测不同处理组中PBMC分泌IFN-γ的水平； 图3为ELISP0T检测不同处理组中PBMC分泌TNF-α的水平； 图4为ELISP0T检测各组PBMC分泌IFN-γ的水平；其中本专利技术融合蛋白的连接肽为GGGGSGGGSGGSGS ； (Gly4Ser) 3-融合蛋白组的连接肽为(Gly4Ser) 3，其他序列均与本专利技术融合蛋白相冋； 图5为ELISPOT检测各组PBMC分泌IFN-γ的水平；实验组孔中含有本专利技术融合蛋白，阳性对照组中含有植物凝集素PHA ; 图6为ELISPOT检测不同处理组中PBMC分泌IFN- γ的水平。【具体实施方式】一种融合蛋白，包含CFP-10、EsxG和EsxH三个蛋白，蛋白之间通过连接肽连接。优选的，连接肽氨基酸序列为GGGGSGGGSGGSGS (SEQ ID NO:3)。更优选的，连接肽的碱基序列如SEQ ID NO:4所示。优选的，CFP_10、EsxG和EsxH蛋白为全序列蛋白或表达抗原活性的部分功能区域多肽。优选的，该融合蛋白为CFP-10-连接肽-EsxG-连接肽-EsxH、CFP-10-连接肽-EsxH-连接肽_EsxG、EsxG_连接肽-CFPlO-连接肽-EsxH、EsxG-连接肽-EsxH -连接肽-CFP10、EsxH-连接肽-CFP-10-连接肽-EsxG或者EsxH-连接肽-EsxG-连接肽-CFP-10。优选的，该融合蛋白为CFP-10-连接肽-EsxG-连接肽-EsxH。优选的，融合蛋白CFP-10-连接肽-EsxG-连接肽-EsxH的氨基酸序列如SEQ IDNO: I所示ο优选的，编码融合蛋白CFP-10-连接肽-EsxG-连接肽-EsxH的核酸序列如SEQ IDNO:2所示。上述任一项所述的融本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种融合蛋白，其特征在于，包含CFP‑10、EsxG和EsxH三个蛋白，蛋白之间通过连接肽连接。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄曦，李金爱，杨锟，田国宝，吴敏昊，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。