一种细胞保护剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种细胞保护剂，该细胞保护剂含有以下组分：终浓度为10～100mmol/L的三羟甲基氨基甲烷，终浓度为9g/L的氯化钠，终浓度为10～40g/L的葡萄糖，终浓度为1～20g/L的蔗糖，终浓度为1～20g/L的丙氨酰谷氨酰胺。本发明专利技术还提供了上述细胞保护剂的制备方法和应用。本发明专利技术将细胞保护剂与血液按照一定的比例混合后，可于5～25℃条件下，保存48小时左右而不影响血液中淋巴细胞的活性。为血液样本的保存和运输提供了方便。

【技术实现步骤摘要】
一种细胞保护剂及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种保护血液中T淋巴细胞活性的细胞保护剂及其制备方法和应用。技术背景目前，市面上加入静脉血中的抗凝剂一般为复方柠檬酸钠保存液(ACD)、EDTA或肝素。为了保证淋巴细胞的活力，加入复方柠檬酸钠保存液(ACD)、EDTA或肝素的抗凝血必须在6小时之内使用。抗凝血的保存时间如果超过10小时，其中的淋巴细胞会部分或者全部死亡，无法进行后续的实验或检测。所以需要开发一种新的细胞保护剂，在血液离体后，保护血液中的淋巴细胞的活力，以为血液的保存及运输提供方便。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种保护血液中T淋巴细胞活性的细胞保护剂及其制备方法和应用。为了达成上述的目的，本专利技术提供了一种新的细胞保护剂。该保护剂包括缓冲液、盐类、糖类、氨基酸等。其中缓冲液为三羟甲基氨基甲烷，盐类为氯化钠，糖类为葡萄糖和蔗糖，氨基酸为丙氨酰谷氨酰胺。将该保护剂与全血以一定的比例混合后，在5～25℃条件下，全血样本可以保存或运输48小时而不影响淋巴细胞的活性。本专利技术采用以下技术方案：一种细胞保护剂，所述细胞保护剂含有以下组分：终浓度为10～100mmol/L的三羟甲基氨基甲烷，终浓度为9g/L的氯化钠，终浓度为10～40g/L的葡萄糖，终浓度为1～20g/L的蔗糖，终浓度为1～20g/L的丙氨酰谷氨酰胺。如上所述的细胞保护剂，优选的，所述细胞保护剂含有以下组分：终浓度为20～50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷，终浓度为9g/L的氯化钠，终浓度为10～20g/L的葡萄糖，终浓度为10～20g/L的蔗糖，终浓度为1～10g/L的丙氨酰谷氨酰胺。如上所述的细胞保护剂，更优选的，所述细胞保护剂含有以下组分：终浓度为20mmol/L的三羟甲基氨基甲烷，终浓度为9g/L的氯化钠，终浓度为20g/L的葡萄糖，终浓度为10g/L的蔗糖，终浓度为5g/L的丙氨酰谷氨酰胺。如上所述的细胞保护剂，更优选的，所述细胞保护剂的pH值为7.1-7.5。一种上述细胞保护剂的制备方法，包括以下步骤：用超纯水配制上述终浓度的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，在该三羟甲基氨基甲烷缓冲液中分别加入上述终浓度的氯化钠、葡萄糖、蔗糖、丙氨酰谷氨酰胺，然后用6mol/L的HCl溶液调节pH至7.1～7.5，得到所述细胞保护剂。一种上述细胞保护剂在用于保护血液样本中T淋巴细胞活性中的应用。如上所述的细胞保护剂的应用，更优选的，在具体使用时，所述细胞保护剂与血液样本的混合体积比例为1:10-1:100。如上所述的细胞保护剂的应用，更优选的，在具体使用时，所述细胞保护剂与血液样本的混合体积比例为1:100。如上所述的细胞保护剂的应用，更优选的，在具体使用时，所述细胞保护剂与血液样本混合后的保存温度为5～25℃。如上所述的细胞保护剂的应用，更优选的，在具体使用时，所述细胞保护剂与血液样本混合后的保存和运输时间长达48小时。本专利技术具有与以下有益效果：本专利技术配制的细胞保护剂易于保存且具有较长的货架期，配制好的细胞保护剂在室温下可以保存1年。本专利技术配制的细胞保护剂与血液样本混合后，可于5～25℃条件下，保存48小时左右而不影响血液中淋巴细胞的活性，温度范围较宽，保存时间较长，为血液样本的运输提供了方便。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术做进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定的，不能以此限定本专利技术的保护范围。以下所用的市售试剂盒为市售的γ-干扰素检测试剂盒，该试剂盒的校准品需经过γ-IFN国际标准品校准。以下试剂或材料，除非特殊说明，均为市售。实施例11.细胞保护剂的配制用超纯水分别配制10mmol/L、20mmol/L、50mmol/L和100mmol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，在上述4种缓冲液中分别加入9g/L的氯化钠，20g/L的葡萄糖，10g/L的蔗糖，10g/L的丙氨酰谷氨酰胺。用6mol/L的HCl溶液调节pH至7.1～7.5。得到细胞保护剂1-4号。2.实验设计2.1采用肝素锂抗凝管采集5例健康人血，每例血10mL，将每例血等分成5份，上述4种细胞保护剂分别与每份血以1:50的体积比例混合，预留一份血不加入保护剂，作为对照组。2.2将5份血液在室温下放置或者运输48小时后，分别取1mL加入结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒(酶联免疫法)的阳性刺激剂刺激管中，加入试剂盒中的IGRA阳性刺激剂(含外源凝集素，可于Sigma公司购买)，上下轻柔颠倒混匀5～10次，37℃水浴锅中孵育20-24小时。2.3分别将刺激管取出，取上清至干净的1.5mL离心管中，做好标记。2.4按照结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒(酶联免疫法)的检测部分说明书对上述血浆进行检测。具体检测步骤如下：2.4.1标准曲线：使用校准品稀释液将γ-干扰素校准品(经国际标准品校准正)稀释成国际标准浓度为4IU/mL、2IU/mL、1IU/mL、0.5IU/mL、0.25IU/mL共6个稀释浓度。各取100μL，按顺序加入板孔中，平行做两孔。2.4.2加样：每孔加入50μlIGRA稀释液，再加入50μL待检血浆样品，4IU/mL、2IU/mL、1IU/mL、0.5IU/mL、0.25IU/mL校准品各2孔，100μl/孔，轻微震荡混匀。2.4.3温育：在37℃的温箱中温育1小时。2.4.4洗涤：甩掉孔内的液体，每孔加入250μl的1×洗涤液洗涤，然后拍干，重复3次。2.4.5加二抗：每孔加入50μlIGRA生物素抗体(主要成分为生物素标记的抗人γ-干扰素单克隆抗体，可使用市售相关材料及生物学常用的稀释液，将其稀释到标准曲线最高浓度点OD值不低于1.5)。2.4.6温育：在37℃的温箱中温育30分钟。2.4.7洗涤：甩掉孔内的液体，每孔加入250μl的1×洗涤液洗涤，然后拍干，重复3次。2.4.8加酶：每孔加入100μl稀释后的IGRA酶复合物(主要成分为亲和素标记的辣根过氧化物酶，可使用市售相关材料及生物学常用的稀释液，将其稀释到标准曲线最高浓度点OD值不低于1.5)。2.4.9温育：在37℃的温箱中避光温育30分钟。2.4.10洗涤：甩掉孔内的液体，每孔加入250μl的1×洗涤液洗涤，然后拍干，重复5次。2.4.11显色：显色剂临用前配制，取等体积的显色剂A液(其为酶联检测的商业化试剂，主要成分为过氧化氢)与显色剂B液(其为酶联检测的商业化试剂，主要成分为四甲基联苯胺盐酸)于15ml试管中混合混匀，然后迅速向每孔加入100μl。2.4.12温育：在37℃的温箱中避光温育15分钟。2.4.13终止：按显色的顺序和速度，向每孔中加入50μl的终止液(主要成分为稀释后的硫酸，一般浓度不超过10wt％)。2.4.14测定：终止液加入后5分钟内用酶标仪读取450nm(以630nm为参比)处的OD值。3.实验结果检测结果如表1所示。表11-4号保护剂由上述表1的结果可知，当三羟甲基氨基甲烷缓冲液的浓度为20mmol/L时，保护剂效果最好，不加保护剂时，血样检测的浓度值会降低。这说明加入保护剂后对血液中的T淋巴细胞活性有一定的保护作用；不加保护剂时，血液中的T淋巴细胞活性会降低。实施例21.细胞保护剂的配制用超纯水配制20本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞保护剂，其特征在于，所述细胞保护剂含有以下组分：终浓度为10～100mmol/L的三羟甲基氨基甲烷，终浓度为9g/L的氯化钠，终浓度为10～40g/L的葡萄糖，终浓度为1～20g/L的蔗糖，终浓度为1～20g/L的丙氨酰谷氨酰胺。

【技术特征摘要】
1.一种细胞保护剂，其特征在于，所述细胞保护剂含有以下组分：终浓度为10～100mmol/L的三羟甲基氨基甲烷，终浓度为9g/L的氯化钠，终浓度为10～40g/L的葡萄糖，终浓度为1～20g/L的蔗糖，终浓度为1～20g/L的丙氨酰谷氨酰胺。2.如权利要求1所述的细胞保护剂，其特征在于，所述细胞保护剂含有以下组分：终浓度为20～50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷，终浓度为9g/L的氯化钠，终浓度为10～20g/L的葡萄糖，终浓度为10～20g/L的蔗糖，终浓度为1～10g/L的丙氨酰谷氨酰胺。3.如权利要求2所述的细胞保护剂，其特征在于，所述细胞保护剂含有以下组分：终浓度为20mmol/L的三羟甲基氨基甲烷，终浓度为9g/L的氯化钠，终浓度为20g/L的葡萄糖，终浓度为10g/L的蔗糖，终浓度为5g/L的丙氨酰谷氨酰胺。4.如权利要求3所述的细胞保护剂，其特征在于，所述细胞保护剂的pH值为7.1-7.5。5....

【专利技术属性】
技术研发人员：丁晓莉，邱志新，黄俊，卢彦羽，赵平锋，
申请(专利权)人：武汉海吉力生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42