一种循环肿瘤细胞分离方法技术

本发明专利技术提供了一种循环肿瘤细胞分离方法，包括如下步骤：1)取血液样本与PBS溶液混匀置于多孔隔膜离心管的隔膜上层，进行密度梯度离心分离；2)将隔膜上层溶液取出置于第一离心管中，离心，去除上清液，得含目的细胞的溶液；3)在第二离心管中加入CD45和CD15混合磁珠，将含目的细胞溶液转入第二离心管，混匀，2～8℃震荡孵育；4)将孵育的混合液置于磁力架上静置，将含目的细胞的上清液转移至第三离心管中，离心，去除上清液，得纯化的循环肿瘤细胞。本发明专利技术采用密度梯度离心和免疫磁珠阴性富集相结合的方法从外周血中分离得到肿瘤细胞，分离周期短，且需要的样品量少，实现了对肿瘤细胞的高度富集，肿瘤细胞回收率高达70％以上，白细胞残留量低于1万个。

A Method for Isolating Circulating Tumor Cells

The invention provides a method for separating circulating tumor cells, which comprises the following steps: 1) taking blood samples and PBS solution and mixing them in the upper layer of the septum of the porous diaphragm centrifugal tube for density gradient centrifugation separation; 2) taking out the upper layer of the diaphragm solution in the first centrifugal tube, centrifuging and removing the supernatant to obtain the solution containing the target cells; 3) mixing CD45 and CD15 in the second centrifugal tube; In combination with magnetic beads, the target cell solution was transferred into the second centrifugal tube, mixed and incubated at 2-8 C. concussion. 4) The incubated mixture was placed on the magnetic frame and the supernatant of the target cell was transferred to the third centrifugal tube. After centrifugation, the supernatant was removed and purified circulating tumor cells were obtained. The method of combining density gradient centrifugation with negative enrichment of immunomagnetic beads is adopted to isolate and obtain tumor cells from peripheral blood. The separation period is short and the amount of sample needed is small. The high enrichment of tumor cells is realized. The recovery rate of tumor cells is over 70%, and the residual amount of white blood cells is less than 10,000.

【技术实现步骤摘要】
一种循环肿瘤细胞分离方法
本专利技术属于循环肿瘤细胞分离
，具体涉及一种循环肿瘤细胞分离方法，主要适用于分离人或者动物血液中的循环肿瘤细胞，去除红细胞、白细胞，得到高纯度的肿瘤细胞。
技术介绍
循环肿瘤细胞(CircμLatingTumorCell，CTC)是外周血中各种肿瘤细胞的统称，其来源于原发肿瘤或者转移肿瘤，获得脱离基底膜的能力并入侵过组织基质进入血管的肿瘤细胞。循环肿瘤细胞比较稀有，一般比血液细胞和正常组织细胞体积大，细胞核大，不规则，细胞核质比高，不易发生变形。肿瘤细胞在进入外周血的过程中会发生上皮-间质转变(EpithelialMesenchymalTransition，EMT)，因此，CTC包括上皮细胞表型、间质细胞表型和上皮细胞-间质细胞混合表型。CTC除了存在不同的类型，还会以不同的形态存在于外周血中，包括游离的单个细胞和聚集成团的细胞团(CircμLatingTumorMicroemboli，CTM)。1869年，澳大利亚医生Ashoworth首次在晚期癌症病人血样中发现CTCs。CTC在外周血中含量极少，每10mL血液中可能仅含有几个到几十个CTC，但是同时约含有5×1011个红细胞、1×108个白细胞和4×109个血小板。由于受当时技术条件和实验仪器限制，很难将CTCs从血液中分离出来进行研究。直到1998年，Racila等首次利用免疫学富集技术和流式细胞技术从乳腺癌病人血样中分离并鉴定了CTCs，此后，多种CTCs分离检测方法相继被开发出来。CTCs的分离方法主要分为非特异性方法和特异性方法，前者主要是根据肿瘤细胞大小、密度、电荷等物理性质，后者则主要是利用肿瘤细胞表面标记物及肿瘤细胞本身的生物学特征进行富集。非特异性富集方法主要包括密度梯度离心、过滤法、其他如红细胞裂解法。由于肿瘤细胞的高度异质性，非特异性分离方法大多存在灵敏度低、损失大、重复性差等缺点。特异性富集方法主要有免疫磁珠分选，其关键是选择合适的肿瘤特异性的抗原。免疫磁珠分选又分为阳性富集法和阴性富集法。阳性富集法是通过磁珠偶联相应的抗体与CTCs表面的抗原结合，直接分离出CTCs。阴性富集法则通过磁珠偶联相应抗体与白细胞表面抗原相结合后去除白细胞，以到达富集CTCs的效果。CellSearch系统是第一个被美国食品和药品管理局(FDA)批准上市用于CTCs检测的产品，其采用免疫磁珠阳性富集法和免疫细胞荧光染色技术相结合检测上皮来源的CTC，主要用于晚期乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌患者的CTCs检测，这三种肿瘤患者的CTCs检出率较高(50-70％)，但是对于其他癌症如肺癌的检出率则明显偏低(30％)。CellSearch系统是用来检测上皮来源的CTC，然而并非所有的肿瘤细胞都来源于上皮细胞，而且上皮肿瘤也可能会丧失上皮标志物，炎症也可能导致血液中存在上皮细胞；此外，CellSearch系统只能捕获并记录CTC数量，不能对CTC进行后续的分子生物学分析，如基因测序、蛋白表达、药物敏感性检测等。因此，CellSearch系统并不是一种理想的CTC富集检测方法。其他CTC富集方法如AdnaTest、微流技术、CTC-ichip等方法也存在和CellSearch系统类似的不足。随着科学技术的发展，CTC下游的检测方法越来越丰富，如荧光原位杂交(Fish)、数字PCR(ddPCR)、单细胞测序、细胞培养等等。因此，如何分离出高质量的CTC成为关键。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有循环肿瘤细胞分离周期长、分离纯度不高、需要依赖于肿瘤细胞表面特殊标记进行分离的问题。为此，本专利技术提供了一种循环肿瘤细胞分离方法，包括如下步骤：1)取新鲜外周血血液样本与PBS溶液混匀置于多孔隔膜离心管的隔膜上层，多孔隔膜离心管的隔膜下层为细胞密度梯度离心液，进行密度梯度离心分离；2)将经过密度梯度离心后的多孔隔膜离心管的隔膜上层溶液取出置于第一离心管中，离心，去除上清液，得含目的细胞的溶液；3)在第二离心管中加入含有CD45和CD15混合磁珠，再将步骤2)中的含目的细胞的溶液加入至第二离心管，混匀，2～8℃震荡孵育；4)将步骤3)中经过孵育的混合液置于磁力架上静置，将含目的细胞的上清液转移至第三离心管中，第三离心管进行离心，去除上清液，即得纯化的循环肿瘤细胞。进一步的，所述新鲜外周血血液样本置于2～8℃环境保存。进一步的，所述多孔隔膜离心管为15mL离心管中加装孔径0.5～0.8mm之间的多孔树脂隔膜，将离心管分隔成上下两部分，下半部分可容纳3mL液体。进一步的，所述细胞密度梯度离心液为Percoll分层液和生理盐水配制而成的密度为1.0500～1.0700g/mL溶液。进一步的，所述步骤1)具体过程：在底部装有细胞密度梯度离心液的多孔隔膜离心管中加入4ml新鲜外周血血液样本与1ml的PBS溶液进行密度梯度离心，且密度梯度离心条件为4℃，1200g，离心25min。进一步的，所述步骤2)中将密度梯度离心后隔膜上层溶液取出置于第一离心管后，向多孔隔膜离心管中加入PBS溶液清洗多孔隔膜管的管壁和隔膜上层，并将PBS洗涤液并入第一离心管中混合，再对第一离心管内溶液进行离心，离心条件为4℃，200g，离心15min。进一步的，所述步骤3)中含有CD45和CD15混合磁珠的制备过程：取1.5mL的第二离心管，加入1mL磁珠孵育缓冲液，分别取10μL的CD45beads和5μL的CD15beads至第二离心管中，混匀，将第二离心管放置到磁力架上，静置2min，去掉液体，保留磁珠，再加入50μL磁珠孵育缓冲液重悬磁珠即可。进一步的，所述步骤4)中含目的细胞的上清液转移至第三离心管后，取磁珠孵育缓冲液重悬磁珠，放置于磁力架上静置2min，将液体并入第三离心管中，再对第三离心管进行离心，离心条件为20℃，200g，离心15min。本专利技术的基本原理：循环肿瘤细胞与红细胞、白细胞、血小板等血液成分的存在密度差异和离心速度差异，利用多孔隔膜分离管、密度梯度离心液和离心，可以将红细胞、部分白细胞和血小板与肿瘤细胞进行分离，得到初步纯化的肿瘤细胞。CD45广泛存在于白细胞表面，是白细胞共同抗原，而CD45在髓细胞中表达较弱，CD45磁珠对髓细胞的去除作用较差，CD15磁珠能够有效去除表达CD15的髓细胞；因而采用含CD45抗体的磁珠和CD15抗体的磁珠对初步纯化的肿瘤细胞进行阴性富集，进一步弃除白细胞包括髓细胞，得到纯度较高的循环肿瘤细胞。与现有技术相比，本专利技术的有益效果：(1)本专利技术提供的这种循环肿瘤细胞分离方法采用密度梯度离心和免疫磁珠阴性富集相结合的方法仅需要90分钟，便能够从4mL人或者动物外周血中分离得到肿瘤细胞，分离周期短，且需要的样品量少，实现了对肿瘤细胞的高度富集，肿瘤细胞回收率高达70％以上，白细胞残留量低于1万个。(2)本专利技术提供的这种循环肿瘤细胞分离方法得到的细胞为活细胞，可直接进行其下游检测分析，如PCR、FISH、免疫荧光、细胞培养等。(3)本专利技术提供的这种循环肿瘤细胞分离方法采用带多孔隔膜的离心管对样本进行密度梯度分离，降低了操作难度，不仅能够有效的防止细胞密度梯度离心液与血液样本预混、离心后隔膜以下的液体污染隔膜以上液体，而且本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种循环肿瘤细胞分离方法，其特征在于：包括如下步骤：1)取新鲜外周血血液样本与PBS溶液混匀置于多孔隔膜离心管的隔膜上层，多孔隔膜离心管的隔膜下层为细胞密度梯度离心液，进行密度梯度离心分离；2)将经过密度梯度离心后的多孔隔膜离心管的隔膜上层溶液取出置于第一离心管中，离心，去除上清液，得含目的细胞的溶液；3)在第二离心管中加入含有CD45和CD15混合磁珠，再将步骤2)中的含目的细胞的溶液加入至第二离心管，混匀，2～8℃震荡孵育；4)将步骤3)中经过孵育的混合液置于磁力架上静置，将含目的细胞的上清液转移至第三离心管中，第三离心管进行离心，去除上清液，即得纯化的循环肿瘤细胞。

【技术特征摘要】
1.一种循环肿瘤细胞分离方法，其特征在于：包括如下步骤：1)取新鲜外周血血液样本与PBS溶液混匀置于多孔隔膜离心管的隔膜上层，多孔隔膜离心管的隔膜下层为细胞密度梯度离心液，进行密度梯度离心分离；2)将经过密度梯度离心后的多孔隔膜离心管的隔膜上层溶液取出置于第一离心管中，离心，去除上清液，得含目的细胞的溶液；3)在第二离心管中加入含有CD45和CD15混合磁珠，再将步骤2)中的含目的细胞的溶液加入至第二离心管，混匀，2～8℃震荡孵育；4)将步骤3)中经过孵育的混合液置于磁力架上静置，将含目的细胞的上清液转移至第三离心管中，第三离心管进行离心，去除上清液，即得纯化的循环肿瘤细胞。2.如权利要求1所述的循环肿瘤细胞分离方法，其特征在于：所述新鲜外周血血液样本置于2～8℃环境保存。3.如权利要求1所述的循环肿瘤细胞分离方法，其特征在于：所述多孔隔膜离心管为15mL离心管中加装孔径0.5～0.8mm之间的多孔树脂隔膜，将离心管分隔成上下两部分，下半部分可容纳3mL液体。4.如权利要求1所述的循环肿瘤细胞分离方法，其特征在于：所述细胞密度梯度离心液为Percoll分层液和生理盐水配制而成的密度为1.0500～1.0700g/mL溶液。5.如权利要求1所述的循环肿瘤细胞分离方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：余小玲，王秀娟，吕阳，朱峰，卢彦羽，赵平锋，
申请(专利权)人：武汉海吉力生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42