本发明专利技术公开了一种用于检测结核感染T细胞的抗原，该抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.29所示，任取SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.29中的八条多肽协同ESAT‑6和CFP‑10多肽及衍生物共同作用，特异性刺激结核分枝杆菌感染的T细胞能特异性的分泌IFN‑γ，增加检测的灵敏度。本发明专利技术提供了一种新的可用于结核感染T细胞的检测试剂盒，使用该试剂盒，直接对外周血进行抗原刺激，无需分离外周血单个核细胞，检测具有较高的灵敏度和特异性，且操作简便，检测成本较低，具有较高的临床应用价值。
【技术实现步骤摘要】
用于检测结核感染T细胞的抗原、试剂盒及应用
本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及用于检测结核感染T细胞的抗原、试剂盒及应用。
技术介绍
结核病是主要经呼吸道传播的、严重危害我国和全世界的重要传染病之一。据世界卫生组织，全世界有17-20亿的结核分枝杆菌感染者，每年至少200万人死于本病(谢建平，结核分枝杆菌功能基因组研究的方法学，微生物通报.2001.28(5):92-97)。因此，准确筛检感染者的方法在结核病的防治甚至最终的消灭中扮演极其重要的作用。现有的诊断技术对结核分枝杆菌感染者的诊断非常难。近几十年来，临床上采用结核菌素试验(TST)来诊断结核分枝杆菌感染者。但TST活性成份是纯蛋白衍生物(purifiedproteinderivativeoftubercμLin，PPD)，是结核分枝杆菌培养上清液的粗提物，含有200多种成分，与卡介苗(BacillusCalmette-Guerin，BCG)接种和环境分枝杆菌感染存在交叉反应。TST检测结果可被现在临床广泛使用的疫苗—卡介苗免疫所干扰[P.Andersen，etal.Lancet356(2000)1099-1104.]。从1921年及明卡介苗到现在为止，全世界已有35亿人接种卡介苗。因此TST对感染者的诊断价值受到很大的影响，导致TST诊断的准确性较低，因此我们无法根据其结果判断是否真正存在结核分枝杆菌感染。对结核病病人的诊断技术中，痰涂片抗酸染色或痰菌培养，培养困难，耗时较长；肺部x射线检查肺部病理改变，也仅在具有典型的临床症状后才能诊断；其他血清学诊断方法和分子诊断方法缺乏特异性，假阳性率较高。有关研究人员指出，不同诊断性检查方法的敏感性和特异性如下：分枝杆菌培养(分别为73％和100％)；PCR(分别为42％和100％)；胸部X线(分别为67％～77％和66％～76％)；结核菌素试验(分别为94％和20％)；血清学(分别为33％和87％)。由此可见，现有的分枝杆菌检测方法的敏感性和特异性无法同时达到最优。结核分枝杆菌感染人体后，首先会被人体的免疫系统识别，激活机体的T细胞免疫应答，分泌产生γ干扰素(IFN-γ)，后者发挥抗结核感染作用。部分T细胞转化为免疫记忆细胞，当再次与结核分枝杆菌相遇后，会再次分泌产生IFN-γ，发挥抗结核感染作用。抗原特异的IFN-γ产生量与机体是否感染或发病密切相关。因此，如果采用结核分枝杆菌特异的抗原在体外刺激感染者和患者的T细胞，可诱导这些T细胞产生高水平的结核分枝杆菌特异的IFN-γ，而非结核分枝杆菌感染者或非结核病患者产生的IFN-γ的量与未用抗原刺激产生的量相近，从而实现诊断的目的。由此可见，寻找并发现结核分枝杆菌特异性抗原，对发展新一代的诊断试剂具有重要价值和意义。1996年，Stover等通过减数杂交的方法确定了BCG在体外传代过程中丢失的域，定义为缺失区(RegionofDifference，RD)，RD区域存在于结核分枝杆菌中，而在BCG和大多数环境分枝杆菌中缺失[程渝,李茂全.结核分枝杆菌的实验室诊断进展.国外医学临床生物化学和检验学分册.2002；23(6)：342-343.]。其中，RD1区域编码的早期分抗原靶6KD(earlysecretingantigentarget6KD，ESAT-6)和培养滤液蛋白10KD(cμLtufiltrateprotein10KD，CFP-10)是两种小分子量分泌蛋白，它们是T细胞最主要的抗原之一，可以诱导较强的细胞免疫反应。对于儿童或者免疫低下样本，有文献报道，仅以ESAT-6和CFP-10或其多肽作为刺激原，其灵敏度约为73.5％-88.9％(孙琳，ELISPOT检测技术在儿童结核病诊断中的应用，标记免疫分析与临床.2008.6:349-353；钟华清，干扰素-γ释放试验在儿童结核感染中的应用价值，检验医学.2016.3:176-179；李海，应用酶联免疫斑点法快速诊断儿童结核分枝杆菌感染的研究，中国妇幼保健，2012.11:1703-1706)。对于一些特殊样本，如儿童、免疫低下及新近感染样本，ESAT-6和CFP-10多肽及衍生物试剂盒结核分枝杆菌样本检出依然不高，仍不能满足临床需求。
技术实现思路
针对现有检测方法对于一些特殊样本，如儿童、免疫低下及新近感染结核分枝杆菌样本的检出不足，本专利技术的目的在于提供一种用于检测结核分枝杆菌感染T细胞的抗原组合物，该抗原组合物特异性刺激结核分枝杆菌感染的新鲜全血，能特异性的分泌IFN-γ，增加检测灵敏度，有效提高检出率，有效避免漏检。一种用于检测结核感染T细胞的抗原组合物，该抗原组合物包括ESAT-6、CFP-10和含有氨基酸序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.29中所示的任八条多肽或任八条以上的多肽组合。如上所述的的抗原组合物，优选地，所述的八条多肽或任八条以上的多肽组合采用与所述SEQIDNO.1～SEQIDNO.29中任一所示序列具有85％及以上同源性的多肽，或采用ESAT-6-CFP-10替换所述ESAT-6、CFP-10。如上所述的抗原组合物，优选地，所述ESAT-6的氨基酸序列如SEQIDNO.30所示，所述CFP-10的氨基酸序列如SEQIDNO.31所示，所述ESAT-6-CFP-10的氨基酸序列如SEQIDNO.32所示。如上所述的抗原组合物，优选地，所述多肽是人工合成的或是天然分离的。一种用于检测结核感染T细胞的试剂盒，包括如上所述的抗原组合物和检测γ-干扰素的试剂。如上所述的试剂盒，优选地，所述检测γ-干扰素的试剂包括酶联免疫吸附试剂、化学发光法检测试剂、免疫荧光检测试剂。如上所述试剂盒的应用，用于检测T细胞经过如上所述的抗原组合物刺激后分泌的细胞因子，所述细胞因子为γ-干扰素。如上所述试剂盒的应用，优选地，所述T细胞来源于外周血、脑脊液、胸水或腹水。如上所述试剂盒的应用，优选地，所述抗原组合物中所述ESAT-6和CFP-10或所述ESAT-6-CFP-10的终浓度各为4～200μg/mL，所述多肽的终浓度为40～1000μg/mL。如上所述试剂盒的应用，优选地，所述检测γ-干扰素的试剂还包括用磷酸盐缓冲液作阴性对照，其检测结果记为N；用所述抗原组合物作为体外刺激物，其检测结果记为T；用外源凝集素和牛血清白蛋白作阳性对照，其检测结果记为P。如上所述试剂盒的应用，优选地，对于所述γ-干扰素的含量，检测结果T-N≥0.15～0.5IU/mL，判断感染结核分枝杆菌；检测结果T-N＜0.15～0.5IU/mL，判断未感染结核分枝杆菌。本专利技术提供的用于检测结核T细胞的抗原及试剂盒，具有以下特点：(1)免疫低下样本阳性检出率高，灵敏度高。针对现有检测方法对于一些特殊样本，如儿童、免疫低下及新近感染样本或潜伏感染者的检出不足，本专利技术提供用于敏感性和特异性高的结核分枝杆菌感染的抗原多肽组合，该多肽组合合并ESAT-6和CFP-10，实现对结核病病人或早期感染者或潜伏感染者(未出现结核病病症)的快速、特异的检测，在阻断结核病的传播和流行，以及对结核病的控制具有重大意义。采用本专利技术的多肽组合结合ESAT-6和CFP-10进行新鲜全血样本刺激，具有良好的诊断符合率。(2)检测用时短，操作方本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测结核感染T细胞的抗原组合物，其特征在于，该抗原组合物包括ESAT‑6、CFP‑10和含有氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.29中所示的任八条多肽或任八条以上的多肽组合。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测结核感染T细胞的抗原组合物，其特征在于，该抗原组合物包括ESAT-6、CFP-10和含有氨基酸序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.29中所示的任八条多肽或任八条以上的多肽组合。2.如权利要求1所述的的抗原组合物，其特征在于，所述的八条多肽或任八条以上多肽的组合采用与所述SEQIDNO.1～SEQIDNO.29中任一所示序列具有85％及以上同源性的多肽，或采用ESAT-6-CFP-10替换所述ESAT-6、CFP-10。3.如权利要求2所述的的抗原组合物，其特征在，所述ESAT-6的氨基酸序列如SEQIDNO.30所示，所述CFP-10的氨基酸序列如SEQIDNO.31所示，所述ESAT-6-CFP-10的氨基酸序列如SEQIDNO.32所示。4.一种用于检测结核感染T细胞的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-3任一所述的抗原组合物和检测γ-干扰素的试剂。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述检测γ-干扰素的试剂包括酶联免疫吸附试剂、化学发光法检...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈银芳，黄俊，张诗冉，丁晓莉，赵平锋，
申请(专利权)人：武汉海吉力生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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