一种联合检测HIV抗原抗体的诊断试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术的一种联合检测HIV抗原抗体的诊断试剂盒采用双抗体夹心法和双抗原夹心法的免疫吸附试验原理，结合时间分辨免疫荧光技术定性检测HIV‑1型p24抗原和HIV‑1/2型抗体；可以将目前HIV检测的窗口期缩短至2～3周，有助于HIV的早期诊断，还可以作为预后判断、评价抗病毒治疗效果的依据；同时本发明专利技术的试剂盒还具有特异性强、灵敏度高、重复性好、稳定性优异、可测定范围宽、检测自动化程度高和无环境污染等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及病毒蛋白免疫分析
，尤其涉及一种联合检测HIV抗原抗体的诊断试剂盒及其制备方法。
技术介绍
人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒(Lentivirus)，属反转录RNA病毒的一种，主要通过性、血液及母婴进行传播。该病毒破坏人体的免疫能力，导致免疫系统失去抵抗力，发展到最后，导致艾滋病(获得性免疫缺陷综合征)。到目前为止尚无有效的抗HIV药物和预防用HIV疫苗，因此筛查控制传染源、切断HIV传播途径，是防止HIV传播感染的重要手段。在HIV感染早期，感染者血液中首先出现HIV的核心抗原p24，且p24的水平随着病毒RNA水平的发展而发展，并在急性感染期即可出现，通常被认为是病毒复制的间接标志，此后的1～2个月内才能产生特异性抗体。目前检测HIV抗原抗体的方法主要有：核酸PCR法、酶免ELISA法以及化学发光CLIA法。核酸PCR法的优点是灵敏度及特异性均较高，但缺点也比较明显就是检测需要配备较复杂的仪器、操作人员需要进行培训，导致检测成本高、操作复杂。酶免ELISA法的优点是操作简单、不需要复杂的仪器、只需要进行简单的培训即可进行操作，但是由于平台所限，其灵敏度相对较低，测定范围相对较窄，而且一般检测窗口期较长。化学发光CLIA法优点是灵敏度、特异性较高，检测范围较宽；缺点是由于大多数板式CLIA试剂盒仍采用EIA相同的酶促反应，以辣根酶或碱性磷酸酶交联抗体，使用鲁米诺或金刚烷等作为底物，检测的是动态发光，导致检测信号值衰减较快、高浓度和低浓度信号衰减速度不一致，限制了其在免疫定量分析中的低端检测灵敏度、稳定性和重复性。
技术实现思路
本专利技术为解决现有技术中的上述问题提出的一种兼具灵敏度高、特异性强、稳定性好、可测定范围宽、试剂有效期长、操作简单等优势的联合检测HIV抗原抗体的时间分辨免疫荧光诊断试剂盒及其制备方法。为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术所采取的技术方案为：一种联合检测HIV抗原抗体的诊断试剂盒，包括包被反应板，还包括镧系元素离子标记的HIV重组抗原、生物素标记的p24抗体、镧系元素离子标记的抗生物素抗体；所述包被反应板为吸附有HIV重组抗原和抗p24单抗的微孔板，所述HIV重组抗原包括HIV-1型抗原和HIV-2型抗原。为了优化上述技术方案，本专利技术采取的技术措施还包括：进一步地，本专利技术的联合检测HIV抗原抗体的诊断试剂盒还包括阴阳性对照、缓冲液、洗涤液、荧光增强液。优选地，本专利技术中所述镧系元素离子为Eu3+、Tb3+、Sm3+、Dy3+中的至少一种，更优选为为Eu3+。优选地，本专利技术使用的荧光增强液含有β-二酮类化合物或芳香胺类化合物。另一方面，本专利技术还提供制备上述联合检测HIV抗原抗体的诊断试剂盒的方法，包括下述步骤：步骤1：制备预处理包被反应板使用黑色聚苯乙烯制备板架，预留与酶标板相互配合的通孔；酶标板经过钴60辐照30天后，与板架配合组装，获得预处理包被反应板，备用；步骤2：包被板的获得用碳酸盐缓冲液将HIV-1和HIV-2重组抗原稀释至0.2-1μg/mL，抗-p24单抗稀释至2-10μg/mL，以100μL/孔包被过夜，然后洗涤、封闭、干燥，将微孔板真空密封于铝箔袋内，冷藏备用；步骤3：制备镧系元素离子标记的HIV重组抗原和镧系元素离子标记的抗生物素抗体HIV-1型抗原、HIV-2型抗原经碳酸盐缓冲液透析后，与镧系元素离子按3:1比例混合，静置24-48小时，用Sephracry G-50分离柱纯化，得到镧系元素离子标记的HIV-1型抗原、镧系元素离子标记HIV-2型抗原；抗生物素抗体经碳酸盐缓冲液透析后，与镧系元素离子按3:1比例混合，静置24-48小时，用Sephadex
G-50分离柱纯化，得到镧系元素离子标记的抗生物素抗体，用保存液将上述镧系元素离子标记的HIV-1型抗原、镧系元素离子标记的HIV-2型抗原及镧系元素离子标记的抗生物素抗体混合保存备用；步骤4：制备生物素标记的p24抗体将抗-p24抗体经磷酸盐缓冲液透析后，与生物素按1:1比例混合，静置2-4小时，再用磷酸盐缓冲液透析，得到生物素标记抗-p24抗体，用稀释液稀释生物素标记抗-p24抗体保存备用；步骤5：荧光增强液的配制以无水乙醇溶解β-NTA、TOPO，再加入令苯二甲酸氢钾和三蒸水，40℃溶解后，加入乙酸、Ttiton X-100，调PH至3.2，定容后保存备用；步骤6：组装各个组分，获得联合检测HIV抗原抗体的诊断试剂盒。优选地，上述镧系元素离子为Eu3+。本专利技术采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：本试剂盒采用的是时间分辨免疫荧光分析法，应用镧系元素作为示踪剂，标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光。同时检测HIV抗体及p24抗原，可以将目前HIV检测的窗口期缩短至2～3周，有助于HIV的早期诊断，还可以作为预后判断、评价抗病毒治疗效果的依据；利用时间分辨免疫荧光分析法同时检出波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异性荧光的干扰，极大的提高了灵敏度；另外，本专利技术的包被反应板的为完全不透光的板架和相应配合的酶标板组成，使得阴性样本与Blank的荧光本底大大降低，信噪比显著提高，酶标板包被采用特殊辐照，使得包被效果显著提高，进而进一步地提高了试剂盒的灵敏度；所述本专利技术试剂盒具有特异性强、灵敏度高、重复性好、稳定性优异、可测定范围宽、检测自动化程度高和无环境污染等优点。附图说明图1为利用本专利技术的试剂盒进行HIV抗体抗原检测的检测原理示意图；图2为本专利技术的试剂盒中包被反应板的板架示意图；图3为专利技术的试剂盒中包被反应板的整体示意图。具体实施方式本专利技术提供了一种联合检测HIV抗原抗体的诊断试剂盒，包括包被反应板，还包括镧系元素离子标记的HIV重组抗原、生物素标记的p24抗体、镧系元素离子标记的抗生物素抗体；所述包被反应板为吸附有HIV重组抗原和抗p24单抗的微孔板，所述HIV重组抗原在包被前需先用处理剂进行处理，所述HIV重组抗原包括HIV-1型抗原和HIV-2型抗原。本专利技术的一种联合检测HIV抗原抗体的诊断试剂盒采用双抗体夹心法和双抗原夹心法的免疫吸附试验原理，结合时间分辨免疫荧光技术定性检测HIV-1型p24抗原和HIV-1/2型抗体。测定程序如附图1所示，微孔表面预包被HIV重组抗原和抗p24单抗，配以生物素标记p24抗体、镧系元素离子标记HIV重组抗原、镧系元素离子标记抗生物素抗体、增强液等其他试剂。当待检样本中存在p24抗原时，在微孔表面反应形成“固相抗p24单抗-p24抗原-生物素标记p24抗体-镧系元素离子标记抗生物素抗体”的免疫复合物；当待检样本中存在HIV抗体时，在微孔表面反应形成“固相HIV重组抗原-HIV抗体-镧系元素离子标记HIV重组抗原”的免疫复合物。然后加入增强液，将固相表面复合物上的镧系元素离子解离至溶液中。镧系元素离子与增强液中的组分形成强荧光络合物，其荧光强度与样本中的HIV-1型p24抗原和HIV-1/2型抗体的浓度成正相关。下面通过具体实施例对本专利技术的试剂盒及其制备方法进行详细和具体的介绍，以使更本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种联合检测HIV抗原抗体的诊断试剂盒，包括包被反应板，其特征在于，还包括镧系元素离子标记的HIV重组抗原、生物素标记的p24抗体、镧系元素离子标记的抗生物素抗体；所述包被反应板为吸附有HIV重组抗原和抗p24单抗的微孔板，所述HIV重组抗原包括HIV‑1型抗原和HIV‑2型抗原。

【技术特征摘要】
1.一种联合检测HIV抗原抗体的诊断试剂盒，包括包被反应板，其特征在于，还包括镧系元素离子标记的HIV重组抗原、生物素标记的p24抗体、镧系元素离子标记的抗生物素抗体；所述包被反应板为吸附有HIV重组抗原和抗p24单抗的微孔板，所述HIV重组抗原包括HIV-1型抗原和HIV-2型抗原。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括阴阳性对照、缓冲液、洗涤液、荧光增强液。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述镧系元素离子为Eu3+、Tb3+、Sm3+、Dy3+中的至少一种。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述镧系元素离子为Eu3+。5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光增强液含有β-二酮类化合物或芳香胺类化合物。6.一种制备如权利要求1所述的试剂盒的方法，其特征在于，包括下述步骤：步骤1：制备预处理包被反应板使用黑色聚苯乙烯制备板架，预留与酶标板相互配合的通孔；酶标板经过钴60辐照30天后，与板架配合组装，获得预处理包被反应板，备用；步骤2：包被板的获得用碳酸盐缓冲液将HIV-1和HIV-2重组抗原稀释至0.2-1μg/mL，抗-p24单抗稀释至2-10μg/mL，以100μL/孔包被过夜，然后洗涤、封闭、干燥，将微孔板真空密封于铝箔袋内，冷藏备用；步骤3：制备镧系元素离子标记的HIV重组抗原和镧系元素离子标记的抗生物素抗体HIV-1型抗原、HIV-2型抗原经碳酸盐缓冲液透析后，与镧系元素离子按3:1比例混合，静...

【专利技术属性】
技术研发人员：张巍，王登瞻，黄加喜，于春红，
申请(专利权)人：苏州新波生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32