本发明专利技术涉及用于检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异株抗体的抗原、间接ELISA的试剂盒以及检测猪流行性腹泻病毒变异株抗体的间接ELISA方法。该抗原包含PEDV S1的主要抗原，利用该抗原蛋白可以特异性检测北京地区流行的PEDV变异株抗体。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及动物疫病检测领域，具体涉及用于检测PEDV变异株抗体的抗原及其ELISA试剂盒和检测方法。
技术介绍
猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)病毒病是由冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起，主要临床症状是哺乳仔猪非常严重的呕吐和腹泻，最后脱水死亡，发病急，是猪的一种传染极强的肠道疾病。最早发现于1971年的英国，随后迅速扩散到世界各地。1976年开始，我国广东、上海等地报道了该病的发生。所有猪只无论品种和大小均易感，母猪、断奶猪、育肥猪、架子猪均有感染性，1周龄内哺乳仔猪感染死亡率达90％-100％。该病具有严重的危害性，给世界生猪市场造成了不可估量的损失。比利时病毒学家Pensaert于1977年通过试验发现并证实了，虽然该病与TGEV在流行病学、临床症状乃至病理变化上都极其相似，但二者并无血清学交叉反应，而属于新的PEDV成员。接种疫苗是其预防的重要手段，1995年起我国开始采用PEDV和TGEV的二联灭活苗和弱毒苗。在一段时间内有效控制了该病的发生，但从2006年起该病出现在了免疫猪群。2010年以来，该病以空前的态势开始暴发，先后在中国大陆、美国、加拿大、日本、中国台湾地区和墨西哥等地发生，我国2010年-2014年猪场腹泻病的罪魁祸首是PEDV。目前的流行毒株基因序列变异大，导致氨基酸的较大变异，致使疫苗临床效果不明显。PED除了致死率不断升高外，流行季节、持续时间和感染范围也与先前报道有所不同，并且猪群发病更加频繁，给世界养猪业带来严重威胁和巨大挑战。PEDV的核酸长28Kb左右，正链RNA，线性不分段并具有侵染性。主要编码4种结构蛋白：核衣壳N、纤突S、小膜E和膜糖M，3种非结构的蛋白：Pol(1a/1b)和ORF3，5'-3'顺序为：5'-Pol(1a/1b)-S-ORF3-E-M-N-3'。专家根据S基因将猪流行性腹泻病毒分为G1和G2两个比较大的基因群，研究发现G1基因群均存在有不同程度的碱基插入或者缺失的现象(主要以基因插入多见)；而G2基因群主要存在有碱基缺失的点突变现象。通过建立S基因进化树，发现G2分支主要是CV777、DR13等活疫苗株和PEDV的早起分离株，G1分支均为新的PEDV流行株，如韩国和美国流行的毒株。PEDV S基因是免疫优势基因，在以S基因为诊断技术研究和候选基因的疫苗中，表现出良好且特异性非常强的免疫原性。有研究表明，抗PEDV的S蛋白的抗体，不与TGEV S蛋白反应，PEDV S蛋白可以很好地作为ELISA检测的靶蛋白。ELISA方法具有灵敏度高、重复性好、特异性强等优点，并且适合大批量样本的检测。该法既可用于测定粪便中的抗原，也可用于测定血清中的抗体，目前被研究者和临床广泛使用，被许多省市级动物疫病预防控制机构实验室所采用，还是国际贸易指定标准诊断方法之一。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供用于检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异株抗体的抗原、间接ELISA试剂盒以及检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA方法。利用本专利技术的抗原及方法和试剂盒可以特异性检测北京地区流行的PEDV变异株抗体。本专利技术的一方面提供用于检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异株的抗原，其氨基酸序列如下：PQDVTRCSANTNFRRFFSKFNVQAPAVVVLGGYLPIGENQGVNSTWYCAGQHPTASGVHGIFVSHIRGGHGFEIGISQEPFDPSGYQLYLHKATNGNTNATARLRICQFPSIKTLGPTANNDVTTGRNCLFNKAIPAHMSEHSVVGITWDNDRVTVFSDKIYYFYFKNDWSRVATKCYNSGGCAMQYVYEPTYYMLNVTSAGEDGISYQPCTANCIGYSANVFATEPNGHIPEGFSFNNWFLLSNDSTLVHGKVVSNQ(SEQ ID NO:1)。在一些实施方案中，所述抗原是重组的。在进一步的实施方案中，所述抗原是由大肠杆菌表达的重组多肽。本专利技术的另一方面提供上述抗原的编码核酸序列。优选所述核酸序列如下(774bp)：CCACAAGATGTCACTAGGTGCTCAGCTAACACTAATTTTAGGCGGTTCTTTTCAAAATTTAATGTTCAGGCGCCTGCAGTTGTTGTACTGGGCGGTTATCTACCTATTGGTGAAAACCAGGGTGTCAATTCAACTTGGTACTGTGCTGGCCAACATCCAACTGCTAGTGGCGTTCATGGTATCTTTGTTAGCCATATTAGAGGTGGTCATGGCTTTGAGATTGGCATTTCGCAAGAGCCTTTTGACCCTAGTGGTTACCAGCTTTATTTACATAAGGCTACTAACGGTAACACTAATGCTACTGCGCGACTGCGCATTTGCCAGTTTCCTAGCATTAAAACATTGGGCCCCACTGCTAATAATGATGTTACAACAGGTCGTAATTGCCTATTTAACAAAGCCATCCCAGCTCATATGAGTGAACATAGTGTTGTCGGCATAACATGGGATAATGATCGTGTCACTGTCTTCTCTGACAAGATCTATTATTTTTATTTTAAAAATGATTGGTCCCGTGTTGCGACAAAGTGTTACAACAGTGGAGGTTGTGCTATGCAATATGTTTATGAACCCACCTATTACATGCTTAATGTTACTAGTGCTGGTGAGGATGGTATTTCTTATCAACCCTGTACAGCTAATTGCATTGGTTATTCTGCCAATGTATTTGCTACTGAGCCCAATGGCCACATACCAGAAGGTTTTAGTTTTAATAATTGGTTTCTTTTGTCCAATGATTCCACTTTGGTGCATGGTAAAGTGGTTTCCAACCAA(SEQ ID NO:2)。本专利技术的另一方面提供用于检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异株抗体的间接ELISA试剂盒，其包含上述抗原。在进一步的实施方案中，该试剂盒中进一步包含间接ELISA检测方法所需的一种或多种其它试剂。在优选的实施方案中，所述一种或多种其它试剂可以选自：96孔板、包被液、洗液、封闭液、酶标二抗、显色剂、终止液、阳性对照、阴性对照以及其它所需的试剂。其中，包被液可以是pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液，其中含有Na2CO3 1.59g/L，NaHCO3 2.93g/L)。其中，洗液可以含有NaCl 8g/L、KCl 0.2g/L、Na2HPO4 1.42g/L，KH2PO4 0.27g/L、0.05％Tween-20，pH7.2。其中，封闭液可以含有NaCl 8g/L、KCl 0.2g/L、Na2HPO4 1.42g/L，KH2PO4 0.27g/L、10％胎牛血清。其中，显色液可以包含A液和B液，其中A液含有醋酸钠27.2g/L、柠檬酸27.2g/L、30％H2O2 0.6ml/L，本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异株抗体的抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
【技术特征摘要】
1.用于检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异株抗体的抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.编码权利要求1的抗原的核酸序列，其序列如SEQ ID NO:2所示。3.用于检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异株抗体的间接ELISA试剂盒，其包含权利要求1的抗原。4.根据权利要求3的试剂盒，其进一步包含间接ELISA检测方法所需的一种或多种试剂，优选所述一种或多种试剂选自：96孔板、包被液、洗液、封闭液、酶标二抗、显色剂、终止液、阳性对照、阴性对照以及其它所需的试剂。5.一种非诊断目的检测样品中猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异株抗体的方法，其特征在于，使用权利要求1的抗原通过间接ELISA方法检测样品中猪流行性腹泻病毒变异株抗体。6.根据权利要求5的方法，其中所述间接ELISA方法包括以下步骤：(1)用纯化的抗原包被固相支持物；(2)在适合于形成抗原抗体免疫复合物的条件下，使固定有上述抗原的固相支持物与待测样品温育；(3)清洗除去未结合的抗体；(4)加入经标记的二抗，在适合于形成抗原抗体免疫复合物的...
【专利技术属性】
技术研发人员：阮文科，
申请(专利权)人：北京农学院，
类型：发明
国别省市：北京;11
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