基于金标银染信号放大技术的食源性致病菌免疫传感器的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了基于金标银染信号放大技术的食源性致病菌免疫传感器的制备方法及其应用，特点是包括载玻片的硅烷化步骤；将氮化碳材料羧基化后与胶体金溶液搅拌混合得到多功能化氮化碳溶液的步骤；将多功能化氮化碳溶液结合食源性致病菌一抗得到食源性致病菌一抗探针的步骤；在硅烷化载玻片上依次滴上偶联试剂，食源性致病菌二抗、食源性致病菌抗原和食源性致病菌一抗探针，即得到基于金标银染信号放大技术的食源性致病菌免疫传感器，通过添加银染试剂进行定量检测分析，优点是特异性好、灵敏度高、结果准确可靠、成本低、简单快速。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种食源性致病菌检测技术，尤其是涉及一种基于金标银染信号放大技术的食源性致病菌免疫传感器的制备方法及其应用。
技术介绍
食源性疾病是指通过摄食了食物中的致病因子而引起的疾病。食源性疾病主要包括：食物中毒、经食物而感染的肠道疾病、食源性寄生虫病、以及食物中有毒、有害污染物所引起的中毒性疾病。食源性疾病中的主要病原物有细菌及其毒素，食源性致病菌是指引起细菌性食物中毒的致病菌，如大肠杆菌、副溶血性弧菌、葡萄球菌、沙门氏菌、变形杆菌等。这些致病菌引起的疾病大多是在夏秋季发生，这与细菌的生活习性相一致，并且动物性食品是引起细菌性食物中毒的主要食品。根据2001年WHO数据报告分析显示，约有220万人因感染食源性疾病而丧生，在我国每年因食源性致病菌造成的重大经济损失达170亿美元。食源性疾病已经成为困扰发达和发展中国家的公共问题，其威胁不容忽视。目前，常见的食源性致病菌检测方法有传统生化法和经典PCR方法。传统生化法有较好的选择性和可靠性，但是用时长且程序繁琐；尽管PCR方法有检测限低和时间短等优势，但易出现假阳性结果且需要专业人员操作。因此，开发灵敏、准确、快速、简便的食源性致病菌检测手段势在必行。金标银染技术最早是被用在核酸分子杂交领域的一种可视化检测技术。其原理是金纳米颗粒（AuNPs）被标记在靶DNA末端，靶DNA与目标DNA杂交，之后再用银染试剂，附着在核酸分子上的纳米金颗粒作为还原剂还原银染试剂中的银离子，单质银被还原显现出黑色的银染信号。在此之后，科研工作者建立一种“夹心式”金标银染的模式，具体做法是：用纳米金标记的抗体制备特异性探针，这种探针能识别其特定的抗原。第一抗体连接在固相支持物上，随后加入待检测物质，最后加入该特异性探针去识别抗原，目标检测物的多少可以根据银染信号的大小来判定。免疫传感器是利用抗体与抗原之间的特异性识别与结合而研制成的一类生物传感器，基于金标银染信号放大技术的免疫传感器是将AuNPs和免疫传感器相结合的产物。其中将AuNPs标记的抗体作为第二抗体去识别相应的抗原，该传感器具备免疫传感器的快速、稳定、选择性强、重现性好、易于操作、步骤简单等特点，同时，通过金标银染技术实现了对目标检测物的可视化检测。石墨相碳化氮（g-C3N4）是一种二维网状材料，具有硬度高、耐磨、化学惰性和良好的生物相容性等特点，被广泛运用于光电子学、生物传感器、环境监测等。目前，有把g-C3N4作为发光基团来检测铜离子和芦丁的报道。由于g-C3N4带正电，可以通过静电作用结合带负电的AuNPs，形成一张带有大量AuNPs的网状g-C3N4，称为多功能化氮化碳材料（Au@g-C3N4）。目前未见基于金标银染技术与多功能化氮化碳材料结合的食源性致病菌免疫传感器的制备方法及其应用的相关报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种特异性好、灵敏度高、结果准确可靠、成本低、快速的基于金标银染信号放大技术的食源性致病菌免疫传感器的制备方法及其应用。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于金标银染信号放大技术的食源性致病菌免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：（1）载玻片的硅烷化将载玻片置于piranha洗液中，于90～100 ℃加热20～40 min后取出，用蒸馏水洗涤三次，置于N2氛中干燥后，浸入硅烷化试剂中室温下硅烷化处理2～6 h，再用乙醇洗净后，于110～130 ℃真空干燥1～3 h后，得到硅烷化载玻片；（2）多功能化氮化碳材料(Au@g-C3N4)的制备方法a. 将三聚氰胺在500～600 ℃下加热3～5 h，真空干燥后，得到氮化碳（g-C3N4）粉末；取0.8～1.5 g 氮化碳粉末加入到80～120 mL 4～6 mol/L HNO3溶液中，于120～150 ℃下回流24～48 h后，自然冷却至室温，水洗涤至pH=7，离心，将沉淀在35～40 ℃下真空干燥12～20 h，得到羧基化的g-C3N4；b. 将80～120 mL 蒸馏水和1～3 mL 1 wt%氯金酸溶液加入到烧杯中，在磁力搅拌下加热至沸腾，迅速加入3～5 mL的1 wt%柠檬酸钠水溶液，继续煮沸直至溶液颜色变成深红色（溶液很快发生颜色变化黑-蓝-深红），沸腾状态下继续加热搅拌20 min，得到胶体金溶液，4 ℃密封保存；c. 将30～70 mg 羧基化的g-C3N4加入到 30～70 mL 胶体金溶液中，室温下搅拌16～24 h，然后离心去除固体颗粒（没有连接上的胶体金），所得溶液即为多功能化氮化碳溶液（Au@g-C3N4）；（3）抗体探针的制备（anti-VP-Au@g-C3N4）取步骤（2）制备的多功能化氮化碳溶液200 μL置于玻璃瓶中，加入80～120 μL 10-3～10-5 mg/mL 食源性致病菌一抗后孵育3～5 h，然后加入80～100 µL 2wt %牛血清白蛋白（BSA）溶液孵育1～2 h（封闭非特异性吸附位点），用蒸馏水清洗离心去除剩余的牛血清白蛋白溶液，即得食源性致病菌一抗探针（anti-VP-Au@g-C3N4）；（4）食源性致病菌免疫传感器的制备在硅烷化载玻片上滴上4～6 μL 的偶联试剂， 30～50 min后滴上食源性致病菌二抗，孵育30～50 min，然后置于2wt%牛血清白蛋白（BSA）溶液中孵育20～30 min，然后加入待测食源性致病菌溶液，反应30～50 min后，滴入步骤（3）得到的食源性致病菌一抗探针，反应30～50 min，用超纯水清洗除去残余的探针，即得到基于金标银染信号放大技术的食源性致病菌免疫传感器。所述的piranha洗液为98%的浓硫酸和30%双氧水以7 : 3的体积比例混合得到；所述的硅烷化试剂为4wt%的3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）溶液；所述的偶联试剂为2.5 wt%的戊二醛溶液。所述的食源性致病菌为副溶血性弧菌（VP）、大肠杆菌O157：H7（E.coli）、金黄色葡萄球菌（SA）或者沙门氏菌（SE）。上述基于金标银染信号放大技术的食源性致病菌免疫传感器检测食源性致病菌的方法，该检测方法不是以疾病诊断为目的，将食源性致病菌免疫传感器的试样点上滴加3～5 uL银染试剂，室温避光反应10～15 min，通过超纯水洗去多余的银染试剂，然后置于空气中干燥，将干燥后载玻片上的金标银染试样点扫描成图片获得待测样品溶液的金标银染信号及其灰度平均值，根据金标银染信号灰度平均值与食源性致病菌溶液浓度之间的定量关系，计算得到待测样品溶液中食源性致病菌的准确浓度。专利技术原理：本专利技术是一种夹心式的免疫传感器，利用抗原和抗体特异性结合作用，结合了g-C3N4片层网状纳米结构材料和AuNPs，制备了一种“免疫夹心”式的生物传感器用来检测细菌，该方法具有普适性。多功能化氮化碳材料是一层二维网状结构，具有巨大的表面积、丰富的表面基团和良好的生物相容性，其表面能吸附大量的AuNPs。AuNPs和g-C3N4靠正负电荷的吸引牢牢结合，经过处理的AuNPs表面带有负电荷能与抗体的正电荷基团静电吸附，AuNPs牢牢地附着在抗体表面，且不会使抗体变性。此刻，g-C3N4就像一张巨大的渔网一样能负载大量的AuNPs，这相对于传统的AuNPs直接吸附抗体的做法来说，大大增本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于金标银染信号放大技术的食源性致病菌免疫传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）载玻片的硅烷化将载玻片置于piranha洗液中，于90～100 ℃加热20‑40 min后取出，用蒸馏水洗涤三次，置于N2氛中干燥后，浸入硅烷化试剂中室温下硅烷化处理2～6 h，再用乙醇洗净后，于110～130 ℃真空干燥1～3 h后，得到硅烷化载玻片；（2）多功能化氮化碳材料的制备方法a. 将三聚氰胺在500～600 ℃下加热3～5 h，真空干燥后，得到氮化碳粉末；取0.8～1.5 g 氮化碳粉末加入到80～120 mL 4～6 mol/L HNO3溶液中，于120～150 ℃下回流24～48 h后，自然冷却至室温，水洗涤至pH=7，离心，将沉淀在35～40 ℃下真空干燥12～20 h，得到羧基化的g‑C3N4；b. 将80～120 mL 蒸馏水和1～3 mL 1 wt%氯金酸溶液加入到烧杯中，在磁力搅拌下加热至沸腾，迅速加入3～5 mL的1 wt%柠檬酸钠水溶液，继续煮沸直至溶液颜色变成深红色，沸腾状态下继续加热搅拌20 min，得到胶体金溶液，4 ℃密封保存；c. 将30～70 mg 羧基化的g‑C3N4加入到 30～70 mL 胶体金溶液中，室温下搅拌16～24 h，然后离心去除固体颗粒，所得溶液即为多功能化氮化碳溶液； （3）抗体探针的制备取步骤（2）制备的多功能化氮化碳溶液200 μL置于玻璃瓶中，加入80～120 μL 10‑3～10‑5 mg/mL 食源性致病菌一抗后孵育3～5 h，然后加入80～100 µL 2wt %牛血清白蛋白溶液孵育1～2 h，用蒸馏水清洗离心去除剩余的牛血清白蛋白溶液，即得食源性致病菌一抗探针；（4）食源性致病菌免疫传感器的制备在硅烷化载玻片上滴上4～6 μL 的偶联试剂， 30～50 min后滴上食源性致病菌二抗，孵育30～50 min，然后置于2wt%牛血清白蛋白溶液中孵育20～30 min，然后加入待测食源性致病菌溶液，反应30～50 min后，滴入步骤（3）得到的食源性致病菌一抗探针，反应30～50 min，用超纯水清洗除去残余的探针，即得到基于金标银染信号放大技术的食源性致病菌免疫传感器。...

【技术特征摘要】
1.一种基于金标银染信号放大技术的食源性致病菌免疫传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）载玻片的硅烷化将载玻片置于piranha洗液中，于90～100 ℃加热20-40 min后取出，用蒸馏水洗涤三次，置于N2氛中干燥后，浸入硅烷化试剂中室温下硅烷化处理2～6 h，再用乙醇洗净后，于110～130 ℃真空干燥1～3 h后，得到硅烷化载玻片；（2）多功能化氮化碳材料的制备方法a. 将三聚氰胺在500～600 ℃下加热3～5 h，真空干燥后，得到氮化碳粉末；取0.8～1.5 g 氮化碳粉末加入到80～120 mL 4～6 mol/L HNO3溶液中，于120～150 ℃下回流24～48 h后，自然冷却至室温，水洗涤至pH=7，离心，将沉淀在35～40 ℃下真空干燥12～20 h，得到羧基化的g-C3N4；b. 将80～120 mL 蒸馏水和1～3 mL 1 wt%氯金酸溶液加入到烧杯中，在磁力搅拌下加热至沸腾，迅速加入3～5 mL的1 wt%柠檬酸钠水溶液，继续煮沸直至溶液颜色变成深红色，沸腾状态下继续加热搅拌20 min，得到胶体金溶液，4 ℃密封保存；c. 将30～70 mg 羧基化的g-C3N4加入到 30～70 mL 胶体金溶液中，室温下搅拌16～24 h，然后离心去除固体颗粒，所得溶液即为多功能化氮化碳溶液；（3）抗体探针的制备取步骤（2）制备的多功能化氮化碳溶液200 μL置于玻璃瓶中，加入80～120 μL 10-3～10-5 mg/mL 食源性致病菌一抗后孵育3～5 h，然后加入80～100 µL 2wt %牛血清白蛋白溶液孵育1～2 h，用蒸馏水清洗离心去除剩余的...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋信信，郭智勇，苏秀榕，胡宇芳，俞欣辰，郭富米，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33