本发明专利技术涉及利用沙门氏菌特异寡核苷酸捕获探针、纳米金标记特异寡核苷酸显示探针与致病菌目标核酸序列之间的DNA杂交，或沙门氏菌多克隆抗体、纳米金标记多克隆抗体与沙门氏菌直接免疫亲和，形成三明治复合体；加入银增强液，杂交或免疫亲和锚定在酶标孔上的纳米金颗粒加速银颗粒的沉积，通过吸光度检测，实现对沙门氏菌的灵敏检测，该方法的检出限可达到33fmol/L(DNA杂交分析)或50cfu/mL(免疫亲和分析)；进一步将沉积的银化学溶出，采用luminol化学发光检测，可使方法的检出限达到0.3fmol/L(DNA杂交分析)或5cfu/mL(免疫亲和分析)。本发明专利技术建立的食源性致病菌检测技术准确、灵敏、快速，对于食品安全具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及利用沙门氏菌序列特异性寡核苷酸捕获探针、金标沙门氏菌寡核苷酸显示探针与沙门氏菌目标核酸序列之间的DNA杂交，形成三明治复合体；或者鼠抗沙门氏菌多克隆抗体直接捕获目标沙门氏菌，再与纳米金标记鼠抗沙门氏菌多克隆抗体结合形成夹心型复合体；随后加入银增强液，杂交或免疫亲和锚定在酶标孔上的纳米金颗粒控制银颗粒的定量沉积，结合光密度检测技术或溶出化学发光检测技术，建立了沙门氏菌新型超灵敏检测体系。属于生物细胞学和微生物菌类检测方法
技术介绍
沙门氏菌(Salmonella)是一种常见、重要的人兽共患病原菌，不仅能导致鸡白痢、仔猪副伤寒、流产等动物疾病，还能使人类发生伤寒、副伤寒、败血症、胃肠炎和食物中毒，在世界各地的食物中毒中，沙门氏菌引起的中毒病例占首位。因此，建立准确、灵敏、快速的沙门氏菌检测技术对于食品安全具有重要意义。目前沙门氏菌的检测方法主要依赖于传统的细菌分离鉴定方法，一般需要4-5天时间，比较费时费力，而免疫酶试验、免疫扩散法、乳胶凝集试验和免疫荧光法及酶联免疫吸附试验(ELISA)等方法，由于操作程序、检测时间、特异性检测等方面尚不理想。聚合酶链反应(PCR)技术虽然具有简便、快速、敏感性高和特异性强的优点，已广泛应用于微生物检测、遗传病诊断等诸多领域，但其引起的实验室环境的污染和使用的染色剂具有致癌性等不足，正越来越引起学者们的注意。这些方法虽能缩短检测时间，但需要特殊的仪器设备或一定的试验条件和实验技能，难以在基层推广。本专利技术的特点就在于它充分利用纳米金标记稳定性好、以纳米金为核的银增强信号放大效果明显、结合DNA杂交分析或免疫亲和分析特异性强、可通过光密度检测亦可通过更灵敏的溶出化学发光检测，从而实现对沙门氏菌的准确超灵敏检测。由于灵敏度的大幅度提高，因此实际检测所需样本量大大减少，可以有效缩短前期增菌培养用时，达到快速检测的目的。
技术实现思路
本专利技术涉及：1)生物素化沙门氏菌序列特异寡核苷酸捕获探针首先通过生物素-亲和素结合作用固定到亲和素包被酶标板上，再通过DNA互补杂交捕获沙门氏菌序列特异目标单链核酸分子，纳米金标记沙门氏菌序列特异性寡核苷酸显示探针进一步通过与目标单链核酸分子杂交，在酶标板孔内形成纳米金标记三明治双链复合物；2)或者固定在微孔板上的沙门氏菌多克隆抗体首先捕获目标沙门氏菌，然后纳米金标记的沙门氏菌多克隆抗体再与目标菌温育结合形成夹心结构；3)通过银染增强，结合在酶标孔内的纳米金标记信号被放大3-6个数量级，结合光密度检测技术或溶出化学发光检测技术，实现对沙门氏菌的超灵敏检测。同时该方法很容易推广应用到其它致病菌的检测工作中。-->具体实验原理如图1、图2所示。具体来说，本专利技术的主要分析步骤如下：1试样制备1.1本专利技术所用沙门氏菌特异性寡核苷酸探针包括：Seq 1：5′-SH-(CH2)6-atatccacgcaggaaataacaggactt-3’(显示探针)；Seq 2：5′-gagcgtgccttaccgacgata-(CH2)6-Biotin-3’(捕获探针)；Seq1和Seq2溶解于TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH 7.4)。本专利技术所用抗体为鼠抗沙门氏菌多克隆抗体。1.2纳米金的制备在圆底烧瓶中加入95.8mL超纯水，再加入4.2mL 1％的氯金酸溶液，磁力加热搅拌，持续煮沸10min；加入10mL 1％的柠檬酸三钠溶液(迅速)，溶液开始有些蓝色，然后变浅蓝色，再加热出现红色；等到出现透明的橙红色，停止加热，将热源除去，继续搅拌15min。图3为所制备纳米金颗粒的紫外-可见吸收光谱，其最大吸收波长为520nm。图4为所制备纳米金颗粒的透射电镜(TEM)图，可以看出纳米金形貌为较均一的球状，粒径在12nm左右。1.3纳米金标记显示探针的制备胶体金溶液500μL，4℃11000r/min离心13min，弃上清。加300nmol/L(pH 7.4的1×TE缓冲液稀释)巯基化沙门氏菌寡核苷酸显示探针(seq1)50μL，混匀，置于4℃环境，反应12h。加等体积含0.2mol/L的TE缓冲液，使NaCl终浓度为0.1M，迅速混匀，置于4℃环境，反应24h。加等体积(50μL)含0.2mol/L NaCl的1×TE缓冲液，使NaCl终浓度为0.1mol/L，迅速混匀，置于4℃环境，反应24h。取上清，4℃，11000r/min离心8分钟，弃上清，加100μL超纯水重悬后再次离心，弃上清，以去除多余的游离寡核苷酸链。加100μL含0.1mol/LNaCl的1×TE缓冲液混匀，置4℃环境储存备用。1.4纳米金标记鼠抗沙门氏菌多克隆抗体的制备纳米金标记鼠抗沙门氏菌多克隆抗体按照以下方法制备：一定量的多抗与1mL纳米金胶体溶液混合，室温下孵育2h。随后于45000g离心30min去除未结合多抗。所得沉淀物即为纳米金标记多抗，将其重悬于0.01mol/L pH 7.6Tris缓冲液中备用。1.5酶标板包被亲和素本专利技术中夹心型DNA杂交产物是通过生物素化的捕获探针与包被于酶标板上的亲和素之间的特异性结合反应固定在了微孔板上。适合的亲和素包被浓度是本专利技术成功与否的基础。对亲和素的包被浓度进行了优化，测定了不同包被浓度下目标探针浓度与银增强后吸光度值的关系，结果显示亲和素包被浓度为10.00mg/L时，目标探针浓度与吸光度值之间具有较好的线性关系，所以选择10.00mg/L为最佳的亲和素包板浓度。酶标板包被亲和素的具体步骤：亲和素(1mg/mL)用碳酸盐包被液按1∶100稀释，每孔包被100μL，置于4℃环境，12h。含0.2mol/LNaCl的0.02mol/LPB(pH 7.0)每孔250μL洗涤3次，5min/次，拍干。用3％牛血清白蛋白(BSA)封闭孔板，防止后面的过程发生非特异性吸附。1.6酶标板包被鼠抗沙门氏菌多克隆抗体-->酶标板微孔每孔加100μL鼠抗沙门氏菌多克隆抗体(10μg/mL配置于0.05M碳酸缓冲液，pH 9.6)4℃孵育过夜，未结合抗体用0.01mol/L PBS-Tween 20(PBST)溶液洗掉。随后每孔用含1％BSA的0.01mol/LPBS在37℃封闭1h。接着用PBST溶液洗涤三次。2分析检测2.1酶标板孔纳米金组装A.DNA杂交法基于夹心型DNA杂交的组装过程如图1所示。选用国标法(GBT 4789.4-2008)对样品中沙门氏菌进行选择性增菌培养，采用商品化试剂盒提取细菌基因组，制备单链目标DNA样品。取20μL 10nmol/L生物素标记探针(seq2)，与用0.1mol/L PBS(pH 7.0，含0.2mol/LNaCl)配制的10μL单链目标DNA，混匀，25℃反应10min。加纳米金标记显示探针(含0.1％BSA)8nmol/L，10μL，混匀，在25℃，反应10min。将该40μL体系杂交产物转移到各酶标板孔，37℃保温20min，倾倒干净。含0.2mol/L NaCl的0.02mol/L PB(pH 7.0)：洗涤1次，拍干，2×PBN(0.3mol/L NaNO3和10mmol/L Na2HPO4本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于纳米金标银增强信号放大技术的沙门氏菌检测方法，其特征在于：(1)沙门氏菌序列特异性寡核苷酸捕获探针、纳米金标记沙门氏菌序列特异性寡核苷酸显示探针与目标菌目标核酸序列之间的DNA杂交，形成三明治复合体；(2)鼠抗沙门氏菌多克隆抗体、纳米金标记鼠抗沙门氏菌多克隆抗体与目标菌直接免疫亲和，形成三明治复合体；(3)加入银增强溶液，组装锚定在酶标孔上的纳米金颗粒加速银颗粒的沉积，通过检测吸光度可对沙门氏菌定量检测；(4)进一步将沉积的银化学溶出，采用luminol化学发光检测，可提高灵敏度10倍以上。
【技术特征摘要】
1.一种基于纳米金标银增强信号放大技术的沙门氏菌检测方法，其特征在于：(1)沙门氏菌序列特异性寡核苷酸捕获探针、纳米金标记沙门氏菌序列特异性寡核苷酸显示探针与目标菌目标核酸序列之间的DNA杂交，形成三明治复合体；(2)鼠抗沙门氏菌多克隆抗体、纳米金标记鼠抗沙门氏菌多克隆抗体与目标菌直接免疫亲和，形成三明治复合体；(3)加入银增强溶液，组装锚定在酶标孔上的纳米金颗粒加速银颗粒的沉积，通过检测吸光度可对沙门氏菌定量检测；(4)进一步将沉积的银化学溶出，采用luminol化学发光检测，可提高灵敏度10倍以上。2.如权利要求1所述一种基于纳米金标银增强信号放大技术的沙门氏菌检测方法，其特征在于纳米金标记沙门氏菌序列特异寡核苷酸显示探针的制备：1)胶体金溶液500μL，4℃ 11000r/min离心13min，弃上清。2)加300nmol/L(pH 7.4的1×TE缓冲液稀释)巯基化沙门氏菌报告寡核苷酸探针(seq1)50μL，混匀，置于4℃环境，反应12h。3)加等体积含0.2mol/L的TE缓冲液，使NaCl终浓度为0.1M，迅速混匀，置于4℃环境，反应24h。3)加等体积(50μL)含0.2mol/L NaCl的1×TE缓冲液，使NaCl终浓度为0.1mol/L，迅速混匀，置于4℃环境，反应24h。4)取上清，4℃，11000r/min离心8分钟，弃上清，加100μL超纯水重悬后再次离心，弃上清，以去除多余的游离寡核苷酸链。5)加100μL含0.1mol/L NaCl的1×TE缓冲液混匀，置4℃环境储存备用。3.如权利要求1所述一种基于纳米金标银增强信号放大技术的沙门氏菌检测方法，其特征在于纳米金标记鼠抗沙门氏菌多克隆抗体复合物的制备：1)胶体金溶液500μL，4℃ 11000r/min离心13min，弃上清。2)加300nmol/L(pH 7.4的1×TE缓冲液稀释)目标菌单克隆抗体(或多克隆抗体)50μL，混匀，置于4℃环境，反应12h。3)加等体积含0.2mol/L的TE缓冲液，使NaCl终浓度为0.1M，迅速混匀，置于4℃环境，反应24h。3)加等体积(50μL)含0.2mol/L NaCl的1×TE缓冲液，使NaCl终浓度为0.1mol/L，迅速混匀，置于4℃环境，反应24h。4)取上清，4℃，11000r/min离心8分钟，弃上清，加100μL超纯水重悬后再次离心，弃上清，以去除多余的游离单抗。5)加100μL含0.1mol/L NaCl的1×TE缓冲液混匀，置4℃环境储存备用。4.如权利要求1所述一种基于纳米金标银增强信号放大技术的沙门氏菌检测方法，其特征在于酶标板包被亲和素的制备：1)亲和素(1mg/mL)用碳酸盐包被液按1∶100稀释，每孔包被100μL，置于4℃环境，12h。2)含0.2mol/L NaCl的0.02mol/L PB(pH 7.0)每孔250μL洗涤3次，5min/...
【专利技术属性】
技术研发人员：王周平，段诺，李井泉，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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