猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法技术

本发明专利技术涉及动物生物制品领域，具体而言，涉及一种猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法。该方法使用细胞ELISA方法的原理进行猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的测定，间接测定繁殖后代的病毒粒子，避免了因各种外界因素致死的病毒粒子的干扰，操作简单、耗时短、精度高，可大幅提高生产效率，是一种值得推广的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量测定方法。

Methods for determining the potency of swine fever virus vaccine

The invention relates to the field of animal biological products, in particular to a method for determining the potency of a hog cholera virus vaccine. The principle of using cell ELISA methods were HCV vaccine virus content determination, indirect determination of breeding virus particles, to avoid the interference of lethal virus particles due to various external factors, simple operation, short time, high accuracy, can greatly improve the production efficiency, it is worthy of popularization of classical swine fever in rabbits attenuated vaccine virus content determination method.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及动物生物制品领域，具体而言，涉及一种猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法。
技术介绍
猪瘟(ClassicalSwineFever，CSF)是由猪瘟病毒(ClassicalSwineFeverVirus，CSFV)引起的一类高发病率的高度接触性传染病。该病被OIE列为A类传染病之一，是国际畜牧兽医产品贸易重要检疫对象。家猪和野猪是CSFV的唯一自然宿主。针对该病尚无有效的治疗药物，通常应用疫苗免疫进行预防，目前，国内广泛使用猪瘟兔化弱毒疫苗来预防猪瘟的发生。CSF临床记载发现于19世纪初期，1903年被证实为病毒感染所致。CSFV感染后导致的病理变化及病程与感染猪的年龄、健康状况、饲养环境和免疫状态息息相关，但更大程度却决于CSFV毒株的毒力强弱。由于猪瘟兔化弱毒疫苗是经家兔传代致弱而来，该病毒注射到家兔体内可以使家兔呈现暂时性的发热反应(兔体热反应实验)，因此在很长一段时间，疫苗生产企业均使用兔体热反应法对疫苗的半成品和成品进行疫苗含量的测定。到目前为止兔体热反应发依然是我国猪瘟疫苗生产企业使用最多的方法。但是在使用该方法时需要选择纯系大耳白兔进行，实验周期最少需要7天，猪瘟疫苗注射入家兔体内后需要连续对家兔进行每天4次的体温测定，这一方法耗时，耗力，存在严重不足，亟需更先进有效的方法提高检测效率。除此之外，目前可以对猪瘟兔化弱毒进行定量的方法还有抗原捕获ELISA方法、免疫荧光检查法、反转录聚合酶链式反应法(RT-PCR)或实时反转录定量PCR(Real-TimePCR)检测法。其中抗原捕获ELISA方法已有商品化的试剂盒可供使用，但是在病毒培养过程中，收获的半成品或成品中同时存在活的猪瘟兔化弱毒、因各种外界因素失活的猪瘟兔化弱毒以及在病毒培养中细胞产生的猪瘟结构蛋白抗原等均能与ELISA包被抗原反应，因此该方法测出的数据大于实际的病毒含量，并未得到公众的认可；RT-PCR和Real-TimePCR法是通过检测病毒核酸来对病毒进行定量，在半成品和成品的检验中不能区分是活的猪瘟兔化弱毒还是失活的猪瘟兔化弱毒，因此在实际中也未广泛使用；免疫荧光定量方法是使用荧光抗体测定感染猪瘟兔化弱毒疫苗的细胞，通过测算不同稀释度出现的荧光的细胞孔数计算病毒含量，该方法的具体实施方法和细节如专利CN201310663187.9(公开日2014.03.05)所述；此外，类似的使用酶标抗体代替荧光抗体对猪瘟病毒进行定量的方法也有报道，该方法见专利CN201010237929.8(公开日2010.12.15)。以上两种方法均需要使用显微镜观察，在使用荧光抗体或酶标抗体时由于染色时间的差异等，特别是在检测样品量大时，容易造成误判，从而定量不准确，同时需要检测人员具有丰富的经验，否则容易因人为因素而形成误判。综上所述，以上方法均具有很多的不足之处，亟需更简便、快速的方法以提高检测精度，提高生产效率。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法，所述方法可解决现有技术测定成本高、测定时间长、测定精度差的问题。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法，包括：1)、将待测猪瘟兔化弱毒疫苗样品用DMEM培养液梯度稀释后将各浓度样品分别接种到预先培养好的敏感细胞中，同时设置加入DMEM培养液的阴性对照及已知病毒效力的猪瘟兔化弱毒疫苗作为阳性对照；加入各浓度样品及对照样品后进行病毒培养；2)、病毒培养完成后去掉细胞培养液，加入固定液进行固定，随后依次加入抗体及TMB显色液；每次换液前均去掉上一次所用溶液并用清洗；3)、加入终止液终止反应；酶标仪读取450nm吸光值并计算病毒效力。本申请提供的测定方法使用细胞ELISA方法的原理进行猪瘟病毒的测定，操作简单、耗时短、精度高，可大幅提高生产效率，是一种值得推广的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法。其中，在步骤2)中，清洗所用的溶液为含有0.05％Tween-20的1×磷酸盐缓冲液。优选的，如上所述的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法，在步骤1)中，所述敏感细胞为猪睾丸细胞、猪肾细胞的原代细胞或传代细胞或兔肾细胞的原代细胞或传代细胞中的一种。优选的，如上所述的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法，在步骤1)中，所述敏感细胞培养于细胞培养板中；接种于所述细胞培养板时的细胞汇合度为90％以上，接种的密度为4～6×105个/mL。细胞汇合度是用来衡量细胞在培养皿中的总的生长情况的一个指标，指两两连接在一起的克隆数目占总的比率；接种密度不宜过小，否则细胞不能很好的生长，也不宜过大，否则细胞会堆积起来，从而降低病毒接种的阳性率。其中，细胞培养板的孔数可根据实验中稀释的梯度数量及每个样所做的副孔数量进行调整，常用48、96、384孔。通常细胞培养板每个孔的容积为300μl左右，因而在以上述细胞密度进行接种时，一般每个孔接种100μl。进一步优选的，如上所述的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法，所述敏感细胞培养于细胞培养板中的培养条件为：在36～38℃，4.5～5.5％CO2的培养环境中培养12～24小时。优选的，如上所述的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法，在步骤1)中，所述梯度稀释的具体操作包括：使用DMEM培养液作为稀释液，以6～20个浓度梯度进行逐步稀释，每个浓度梯度的稀释倍数均为2～15倍。浓度梯度的数量是根据细胞密度及初始病毒含量(估计值)进行确定的；稀释倍数过大则每次稀释的误差会增大，因而最大稀释倍数限定在15倍。优选的，如上所述的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法，在步骤1)中，所述病毒培养条件为：在36～38℃，4.5～5.5％CO2的培养环境中培养48～96小时。优选的，如上所述的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法，在步骤2)中，所述固定液为甲醇和丙酮1:1配制固定液；固定的条件和时间为：2～8℃静置30～60min。甲醇丙酮固定液配置时候按照体积比1：1进行配置，加入固定液处理可以防止细胞发生自溶并保存细胞固有物质，使细胞基本上保持与生活时的物质一致。固定时间不宜过短也不宜过长，时间过短固定不完全，将降低抗原的反应灵敏度，造成假阴性结果；固定时间过长会造成细胞脱造成假阳性结果。优选的，如上所述的猪瘟兔化弱毒本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法，其特征在于，包括：1)、将待测猪瘟兔化弱毒疫苗样品用DMEM培养液梯度稀释后将各浓度样品分别接种到预先培养好的敏感细胞中，同时设置加入DMEM培养液的阴性对照及已知病毒效力的猪瘟兔化弱毒疫苗作为阳性对照；加入各浓度样品及对照样品后进行病毒培养；2)、病毒培养完成后去掉细胞培养液，加入固定液进行固定，随后依次加入抗体及TMB显色液；每次换液前均去掉上一次所用溶液并清洗；3)、加入终止液终止反应；酶标仪读取450nm吸光值并计算病毒效力。

【技术特征摘要】
1.一种猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法，其特征在于，包
括：
1)、将待测猪瘟兔化弱毒疫苗样品用DMEM培养液梯度稀释
后将各浓度样品分别接种到预先培养好的敏感细胞中，同时设置加
入DMEM培养液的阴性对照及已知病毒效力的猪瘟兔化弱毒疫苗
作为阳性对照；加入各浓度样品及对照样品后进行病毒培养；
2)、病毒培养完成后去掉细胞培养液，加入固定液进行固定，
随后依次加入抗体及TMB显色液；每次换液前均去掉上一次所用
溶液并清洗；
3)、加入终止液终止反应；酶标仪读取450nm吸光值并计算病
毒效力。
2.如权利要求1所述的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法，
其特征在于，在步骤1)中，所述敏感细胞为猪睾丸细胞、猪肾细
胞的原代细胞或传代细胞或兔肾细胞的原代细胞或传代细胞中的一
种。
3.如权利要求1所述的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法，
其特征在于，在步骤1)中，所述敏感细胞培养于细胞培养板中；
接种于所述细胞培养板时的细胞汇合度为90％以上，接种的密度为
4～6×105个/mL。
4.如权利要求3所述的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法，
其特征在于，所述敏感细胞培养于细胞培养板中的培养条件为：
在36～38℃，4.5～5.5％CO2的培养环境中培养12～24小时。
5.如权利要求1所述的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒效力测定方法，
其特征在于，在步骤1...

【专利技术属性】
技术研发人员：周远成，蔡雨函，
申请(专利权)人：四川华神兽用生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51