快速选育猪瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感细胞系的方法及专用引物技术

本发明专利技术公开了一种用逆转录PCR(RT‑PCR)技术和实时荧光定量RT‑PCR技术快速选育猪瘟兔化弱毒株(C株)ST(猪睾丸)敏感细胞系的方法。包括1)获得ST单克隆细胞；2)接种猪瘟兔化弱毒株(C株)；3)提取连续收获的各批次猪瘟兔化弱毒液(病毒液)的RNA，用RT‑PCR技术确定ST单克隆细胞系能够持续感染猪瘟兔化弱毒(C株)；4)用实时荧光定量RT‑PCR技术确定拷贝数在106拷贝(copies)/mL以上的为猪瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感细胞系。本发明专利技术能够快速的为猪瘟弱毒疫苗的生产提供敏感细胞系，缩短了疫苗生产周期并降低了疫苗成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，特别是涉及一种用RT-PCR技术(即逆转录PCR)和实时荧光定量RT-PCR技术快速选育猪瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感细胞系的方法。
技术介绍
猪瘟是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的一种急性、热性、高度传染性和致死性的烈性传染病，俗称烂肠瘟，早年又称猪霍乱。该病是发生最多、危害最大、流行最广的猪传染病。近年来中国因病死亡猪数占饲养总数的8％-10％，其中三分之一是由猪瘟引起的。世界动物卫生组织(OIE)将猪瘟列为A类16种法定传染病之一，我国也将猪瘟定为一类烈性传染病，属于危害严重、需要采取紧急严厉的强制预防、控制和扑灭的动物疫病之一。猪瘟遍布于全世界，具有高度接触传染性。目前，疫苗接种是预防控制猪瘟的重要手段，许多国家和地区已先后宣布消灭了猪瘟。中国猪瘟兔化弱毒疫苗以其具有诱生免疫反应快，对种猪、乳猪无残余毒力，免疫猪可抵抗猪瘟强毒株的攻击等特点，成为国际上公认的最安全有效的弱毒疫苗。目前用于免疫的猪瘟疫苗主要有四种：脾淋苗、乳兔苗、细胞苗和联苗。这四种疫苗的猪瘟毒株均是中国系猪瘟兔化弱毒株(简称C株)。猪瘟脾淋苗和乳兔苗是兔源组织苗，是利用成兔和乳兔的活组织生产制备的。由于猪瘟脾淋苗和乳兔苗使用动物的免疫器官做成，虽然免疫效果较好，但是成本高，容易污染，产量低，批次间差异大，而且免疫注射后应激反应大。而猪瘟细胞苗具有生产成本低，适用于批量生产，批间差异小，副反应低等特点越来越受到重视。但是由于在猪瘟细胞苗生产过程中，细胞产毒效果差，病毒滴度较低，导致疫苗成品的免疫效果不及猪瘟脾淋苗。因此，筛选对猪瘟兔化弱毒株敏感的细胞系，以提高病毒滴度对猪瘟细胞苗的生产具有现实意义，并可带来经济效益。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用RT-PCR技术和实时荧光定量RT-PCR技术快速选育猪瘟兔化弱毒株(C株)ST(猪睾丸细胞)敏感细胞系的方法，以克服现有猪瘟细胞疫苗生产中存在的免疫效果不理想的缺陷。本专利技术所提供的快速选育猪瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感细胞系的方法，主要包
括以下步骤：1)获得ST单克隆细胞；2)接种猪瘟兔化弱毒株(C株)；3)提取连续收获的各批次猪瘟兔化弱毒液(病毒液)的RNA，用RT-PCR技术进行初步鉴定，确定ST单克隆细胞系能够持续感染猪瘟兔化弱毒(C株)；4)用实时荧光定量RT-PCR技术定量检测猪瘟兔化弱毒液，以确定猪瘟兔化弱毒株(C株)的拷贝数，猪瘟兔化弱毒株(C株)能够持续感染细胞，并且确定在第三批次以及以后批次收获的病毒液的拷贝数能够维持在106拷贝(copies)/mL的是猪瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感细胞系。在上述方法中，所述步骤1)ST单克隆细胞的获得方法为：将无外源病毒污染的ST细胞在37℃、5％CO2培养箱中培养48h，用0.2％(质量/体积，W/V，单位g/100mL)的胰蛋白酶消化成单个散在的细胞后进行细胞计数，然后用为15％(体积/体积，V/V，单位mL/100mL)血清的DMEM培养基稀释至细胞浓度为10-100cells/mL，用移液器加样至96孔板，每孔100μL，显微镜下观察，记录并标记只含有一个细胞的孔，每天观察，细胞数量增加后，再逐步扩大培养，得到ST单克隆细胞。所述步骤2)中接种猪瘟兔化弱毒株(C株)的方法为：将猪瘟兔化弱毒株(C株)接种ST单克隆细胞，在37℃、5％CO2培养箱中培养，每48h收获病毒液，连续收获8个批次毒液，每个批次病毒液置于-80℃短期保存待检。所述步骤3)中的RT-PCR鉴定方法，可包括以下步骤：3.1)提取猪瘟兔化弱毒液(病毒液)的总RNA；3.2)以病毒液的总RNA为模板逆转录合成其cDNA；3.3)RT-PCR检测：以cDNA为模板，在RT-PCR特异性引物的引导下进行PCR扩增，反应结束后对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，若能扩增出长度为383bp的目的片段，则检测结果为阳性，反之为阴性。所述步骤3.2)中是对所提取的RNA用反转录试剂盒进行两步法反转录，第一步反应体系为：Oligo dT Primer(50uM)1μL，dNTP Mixture(10mM each)1μL，TemplateRNA 2μL，Rnase free ddH2O 6μL，反应条件为：65℃5min，迅速冷却；第二步反应体系为：Template RNA and Primer Mixture(第一步的产物)10μL，5*PrimeScriptII Buffer 4μL，Rnase inhibitor(40U/μL)0.5μL，PrineScript II RTase(200U/μL)1μL，Rnase free H204.5μL，反应条件为：混匀，42℃30-60min，95℃5min，冰上冷却。所述步骤3.3)中用于RT-PCR鉴定的特异性引物，是以猪瘟兔化弱毒株(C株)
的全基因组的特异性保守区域内自5’端第54-436bp(序列表中SEQ ID NO：1)为对象设计的，目的片段长383bp，用以检测ST单克隆细胞是否能够持续感染猪瘟兔化弱毒株(C株)。所述步骤3.3)中用于RT-PCR鉴定的上游引物具有序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。所述步骤3.3)中的RT-PCR反应体系为：模板cDNA 1μL，2×Taq PCR Master MIX12.5μL，上游引物(10μM/μL)1μL，下游引物(10μM/μL)1μL，加Rnase freeH2O至25μL；所述RT-PCR的反应条件为：先94℃预变性，5min；然后94℃变性30s，56℃-64℃退火20s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸10min。所述步骤4)中的实时荧光定量RT-PCR检测方法，可包括以下步骤：4.1)建立标准曲线：将猪瘟病毒(C株)作为标准品，梯度稀释成1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101copies/μL，以不同浓度的标准品作为模板，在引物和TaqMan探针的引导下进行实时荧光定量PCR检测，检测结束后，以各标准品的浓度Log值(X轴)对其相应Ct值(Y轴)作图，绘制标准曲线；4.2)提取猪瘟兔化弱毒液(病毒液)的基因组RNA，以提取的基因组RNA为模板，在引物和TaqMan探针的引导下进行猪瘟病毒(C株)实时荧光定量RT-PCR检测；4.3)根据荧光信号的变化及强度，对待测样品中的猪瘟病毒(C株)进行定性、定量检测，出现荧光扩增曲线表明样品中含有猪瘟病毒，未出现荧光扩增曲线表明样品中不含有猪瘟病毒，再根据样品的荧光信号强度和步骤1)中的标准曲线，得出待测样品中所含的猪瘟病毒的拷贝数。所述步骤4.1)和4.2)中用于实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针，是以猪瘟兔化弱毒株(C株)的全基因组的特异性保守区域内自5’端第151-243bp为对象设计的，目的片段长93bp(序列表中SEQ ID NO：4)，用以确定病毒的拷贝数(实时荧光定量PCR扩增的目的片段93bp是本文档来自技高网...

【技术保护点】
快速选育猪瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感细胞系的方法，主要包括以下步骤：1)获得ST单克隆细胞；2)接种猪瘟兔化弱毒株(C株)；3)提取连续收获的各批次猪瘟兔化弱毒液(病毒液)的RNA，用RT‑PCR技术进行初步鉴定，确定ST单克隆细胞系能够持续感染猪瘟兔化弱毒(C株)；4)用实时荧光定量RT‑PCR技术定量检测猪瘟兔化弱毒液，以确定猪瘟兔化弱毒株(C株)的拷贝数，确定猪瘟兔化弱毒株(C株)能够持续感染细胞，并且在第三批次以及以后批次收获的病毒液的拷贝数能够维持在106拷贝(copies)/mL的确定为猪瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感细胞系。

【技术特征摘要】
1.快速选育猪瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感细胞系的方法，主要包括以下步骤：1)获得ST单克隆细胞；2)接种猪瘟兔化弱毒株(C株)；3)提取连续收获的各批次猪瘟兔化弱毒液(病毒液)的RNA，用RT-PCR技术进行初步鉴定，确定ST单克隆细胞系能够持续感染猪瘟兔化弱毒(C株)；4)用实时荧光定量RT-PCR技术定量检测猪瘟兔化弱毒液，以确定猪瘟兔化弱毒株(C株)的拷贝数，确定猪瘟兔化弱毒株(C株)能够持续感染细胞，并且在第三批次以及以后批次收获的病毒液的拷贝数能够维持在106拷贝(copies)/mL的确定为猪瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感细胞系。2.根据权利要求1所述的快速选育猪瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感细胞系的方法，其特征在于：所述步骤1)ST单克隆细胞的获得方法为：将无外源病毒污染的ST细胞在37℃、5％CO2培养箱中培养48h，用0.2％(质量/体积，W/V，单位g/100mL)的胰蛋白酶消化成单个散在的细胞后进行细胞计数，然后用为15％(体积/体积，V/V，单位mL/100mL)血清的DMEM培养基稀释至细胞浓度为10-100cells/mL，用移液器加样至96孔板，每孔100μL，显微镜下观察，记录并标记只含有一个细胞的孔，每天观察，细胞数量增加后，再逐步扩大培养，得到ST单克隆细胞。3.根据权利要求1或2所述的快速选育猪瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感细胞系的方法，其特征在于：所述步骤2)中接种猪瘟兔化弱毒株(C株)的方法为：将猪瘟兔化弱毒株(C株)接种ST单克隆细胞，在37℃、5％CO2培养箱中培养，每48h收获病毒液，连续收获8个批次毒液，每个批次病毒液置于-80℃短期保存待检。4.根据权利要求1或2或3所述的快速选育猪瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感细胞系的方法，其特征在于：所述步骤3)中的RT-PCR鉴定方法，可包括以下步骤：3.1)提取猪瘟兔化弱毒液(病毒液)的总RNA；3.2)以病毒液的总RNA为模板逆转录合成其cDNA；3.3)RT-PCR检测：以cDNA为模板，在RT-PCR特异性引物的引导下进行PCR扩增，反应结束后对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，若能扩增出长度为383bp的目的片段，则检测结果为阳性，反之为阴性。5.根据权利要求4所述的快速选育猪瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感细胞系的方法，其特征在于：所述步骤3.2)中是对所提取的RNA用反转录试剂盒进行两步法反转录，第一步反应体系为：Ol igo dT Primer(50uM)1μL，dNTP Mixture(10mM each)
\t1μL，Template RNA 2μL，Rnase free ddH2O 6μL，反应条件为：65℃5min，迅速冷却；第二步反应体系为：Template RNA and Primer Mixture(第一步的产物)10μL，5*PrimeScript II Buffer 4μL，Rnase inhibitor(40U/μL)0.5μL，PrineScriptII RTase(200U/μL)1μL，Rnase free H204.5μL，反应条件为：混匀，42℃30-60min，95℃5min，冰上冷却。6.根据权利要求4或5所述的快速选育猪瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感细胞系的方法，其特征在于：所述步骤3.3)中用于RT-PCR鉴定的上游引物具有序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID N...

【专利技术属性】
技术研发人员：商晓桂，张贵刚，郝鹏，魏学峰，刘国英，范秀丽，韩志玲，宋志刚，孔彩萍，王艳杰，
申请(专利权)人：金宇保灵生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15